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VP-16对HIV-1潜伏感染再激活作用的研究

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中华实验和临床病毒学杂志 2022年第1期36卷 8-14页

作者：陈灿灿张玮琦马寒羽脱颖中山大学附属第一医院病理科广州510080

目的探索依托泊苷(VP-16)对人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)潜伏感染的激活作用并研究其潜在的分子机制。方法将HIV-1潜伏感染细胞系J-Lat分为二甲基亚砜(DMSO)处理组、VP-16处理组及伏立诺他(SAHA)处理组,利... 详细信息

目的探索依托泊苷(VP-16)对人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)潜伏感染的激活作用并研究其潜在的分子机制。方法将HIV-1潜伏感染细胞系J-Lat分为二甲基亚砜(DMSO)处理组、VP-16处理组及伏立诺他(SAHA)处理组,利用流式细胞技术检测细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性比例,评估高浓度VP-16对HIV-1潜伏感染的激活效率;通过流式细胞技术检测VP-16在不同作用浓度及不同作用时间下对HIV-1潜伏感染的激活效果;通过流式细胞技术检测在VP-16作用下J-Lat细胞中CD25、CD69及白介素-6(interleukin-6,IL-6)的表达情况;运用双荧光素酶报告系统检测VP-16对HIV-1长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)转录水平的影响;使用蛋白质印迹技术(western blot,WB)检测VP-16作用下蛋白沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)及核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)乙酰化p65的表达水平;利用慢病毒介导的靶向SIRT1短发夹RNA(SIRT1 short-hairpin RNA,SIRT1-shRNA)敲低J-Lat细胞的SIRT1表达并检测相应的激活效果。结果流式细胞技术分析结果显示,VP-16能够特异性地激活HIV-1潜伏感染细胞系J-Lat,其激活效果存在浓度依赖和时间依赖;VP-16激活HIV-1潜伏感染的同时会一定程度上调J-Lat细胞的CD25及CD69,但IL-6的表达水平无明显变化;双荧光素酶报告实验提示VP-16通过NF-κB信号通路正向调控HIV-1 LTR的转录水平;WB结果表明VP-16能够抑制SIRT1的蛋白表达并促进NF-κB p65的乙酰化水平;慢病毒SIRT1-shRNA成功敲低J-Lat细胞中SIRT1的mRNA和蛋白表达,能够有效激活HIV-1潜伏感染。结论VP-16通过抑制SIRT1表达从而上调NF-κB p65的乙酰化水平,继而促进HIV-1 LTR的转录并最终激活HIV-1的潜伏感染。

关键词： VP-16 HIV-1 潜伏感染 SIRT1

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人巨细胞病毒潜伏感染机制的研究进展

病毒学报 2016年第1期32卷 82-87页

作者：高慧慧陶然俞惠民尚世强浙江大学医学院附属儿童医院杭州310003

人巨细胞病毒(HCMV)的潜伏感染在人群中极为普遍。在儿科学领域,潜伏感染的巨细胞病毒激活后,可能导致死胎、流产、胎儿畸形、生长发育迟缓等一系列严重后果。在病毒潜伏感染过程中,机体会通过免疫反应或诱导宿主细胞凋亡等方式清除病... 详细信息

人巨细胞病毒(HCMV)的潜伏感染在人群中极为普遍。在儿科学领域,潜伏感染的巨细胞病毒激活后,可能导致死胎、流产、胎儿畸形、生长发育迟缓等一系列严重后果。在病毒潜伏感染过程中,机体会通过免疫反应或诱导宿主细胞凋亡等方式清除病毒。然而,在病毒与宿主共同进化的漫长过程中,病毒会调控自身基因的表达、宿主细胞微环境及免疫杀伤作用,从而达到与长期宿主共存的目的。目前研究揭示,HCMV的潜伏感染可能与病毒立即早期启动子沉默、病毒干扰宿主细胞凋亡、病毒免疫逃逸及非编码RNA调控机制有关。本文将从以上四个方面对HCMV潜伏感染相关机制的研究进展进行总结。

关键词：人巨细胞病毒潜伏感染立即早期启动子免疫反应

伪狂犬病毒在小鼠原代神经细胞中潜伏感染模型的建立

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中国预防兽医学报 2023年

作者：向广韬吴红霞王异民周末王亚林王翌尹航仇华吉孙元中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

由于缺少良好的潜伏感染模型，人们对PRV潜伏感染机制知之甚少。本研究旨在为研究PRV的潜伏感染建立体外细胞模型。通过分离新生鼠背根神经节（DRG）获取神经细胞，并用间接免疫荧光（IFA）的方法对其进行鉴定，获得了DRG中的神经细胞... 详细信息

由于缺少良好的潜伏感染模型，人们对PRV潜伏感染机制知之甚少。本研究旨在为研究PRV的潜伏感染建立体外细胞模型。通过分离新生鼠背根神经节（DRG）获取神经细胞，并用间接免疫荧光（IFA）的方法对其进行鉴定，获得了DRG中的神经细胞。用报告重组病毒（rPRV-EGFP）感染此神经细胞，同时添加阿昔洛韦（ACV）抑制病毒复制以建立潜伏感染。并对影响潜伏感染的条件，病毒接种剂量和ACV的浓度进行优化。结果显示，感染复数（MOI）为0.001,ACV浓度为0.5 mmol/L，病毒能够在神经细胞上稳定地建立潜伏感染。用荧光定量RT-PCR、测定病毒滴度、药物刺激再激活的方法对潜伏感染进行了鉴定。结果显示，潜伏感染时病毒不能复制，且不产生感染性病毒粒子；而经LY294002(PI3K抑制剂)诱导病毒再激活后，病毒大量复制并产生感染性病毒粒子。本研究利用小鼠原代神经细胞建立了PRV的潜伏感染模型，该模型的建立为PRV潜伏感染机制的研究奠定了基础。

关键词：伪狂犬病毒小鼠背根神经节潜伏感染再激活模型

HIV/AIDS合并结核分枝杆菌潜伏感染特征及影响因素分析

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中国热带医学 2022年第8期22卷 739-743页

作者：谢周华韦柳迎董文逸黄献珍黎彦君卢焕吴幸幸李志峰南宁市第四人民医院广西艾滋病临床治疗中心广西南宁530023

目的探讨HIV/AIDS患者结核分枝杆菌潜伏感染状况及影响因素,为开展结核病潜伏感染预防性干预提供依据。方法以2020年1月—2021年3月南宁市第四人民医院确证为HIV感染且未患结核的患者为研究对象,进行γ-干扰素释放试验,以结核分枝杆菌... 详细信息

目的探讨HIV/AIDS患者结核分枝杆菌潜伏感染状况及影响因素,为开展结核病潜伏感染预防性干预提供依据。方法以2020年1月—2021年3月南宁市第四人民医院确证为HIV感染且未患结核的患者为研究对象,进行γ-干扰素释放试验,以结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)者为观察组,单纯HIV/AIDS患者为对照组,调查流行病学特征并对潜伏感染的可能影响因素,如性别、年龄、民族、居住地、BMI、家庭人均月收入、基础性疾病、结核病密切接触史、卡介苗接种史、CD4^(+)T淋巴细胞、HIV感染病程、合并机会性感染等12项按α=0.10的水准进行单因素筛选,将单因素分析结果纳入Logistic回归分析,探讨HIV/AIDS患者结核分枝杆菌潜伏感染影响因素。结果650例HIV/AIDS患者中发现LTBI 112例,检出率17.23%。将单因素分析有统计学意义的6个因素纳入多因素Logistic回归分析,最终进入回归模型的因素为CD4^(+)T淋巴细胞、结核病密切接触史、HIV感染病程、合并其他机会性感染,其调整的OR值及OR95%CI分别为4.143(1.784~9.637),2.826(1.359~6.063),1.825(1.159~2.874),1.714(1.128~2.606)。结论HIV/AIDS患者结核分枝杆菌潜伏感染密切的相关影响因素为CD4^(+)T淋巴细胞感染病程≥4年、合并其他机会性感染,应关注该类人群结核病的发展趋势,及时给予预防性治疗,避免HIV病毒和结核分枝杆菌双重感染的协同恶化。

关键词： HIV/AIDS 潜伏感染 γ-干扰素释放试验影响因素回归分析

PDCD2及其剪切异构体在T细胞及HIV潜伏感染T细胞中的凋亡作用

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PDCD2及其剪切异构体在T细胞及HIV潜伏感染T细胞中的凋亡作用

作者：余雯惠北京协和医学院

学位级别：硕士

T细胞是人体重要的一类免疫细胞,在抵抗病原微生物以及维持机体的正常免疫功能中发挥重要作用。CD4+T细胞是人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染的主要靶细胞,随着疾病进展,机体的CD4+T细胞会大量减少,以致引发一... 详细信息

T细胞是人体重要的一类免疫细胞,在抵抗病原微生物以及维持机体的正常免疫功能中发挥重要作用。CD4+T细胞是人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染的主要靶细胞,随着疾病进展,机体的CD4+T细胞会大量减少,以致引发一系列的机会性感染,最终进展为艾滋病(Acquired immune deficiency syndrome,AIDS)。HIV 能整合到细胞的基因组中,以 HIV前病毒DNA的形式藏匿在组织细胞内从而不易被体内的免疫系统所识别,最终形成病毒潜伏库,HIV潜伏库是当今艾滋病难以实现治愈的重要障碍。程序性细胞死亡蛋白 2(Programmed cell death protein 2,PDCD2)是一种高度保守的真核蛋白,广泛分布于人体的多种组织,在细胞凋亡中发挥重要的调节作用。PDCD2存在多种剪切形式,其不同剪切异构体的功能机制仍不明确,而且PDCD2及其剪切异构体对T细胞以及HIV潜伏感染T细胞的凋亡作用机制仍需深入探讨。本研究中,我们构建了含有人PDCD2即PDCD2(H)、猴PDCD2即PDCD2(RM)、三种剪切形式包括PDCD2(HS3)、PDCD2(HS4)、PDCD2(HS7)基因的重组慢病毒表达质粒,通过慢病毒包装及感染的方式在T淋巴细胞系来源的Jurkat和HIV潜伏感染细胞ACH2中分别过表达这些基因,建立了多个稳定细胞株,研究PDCD2及其剪切异构体在凋亡诱导剂刺激下的细胞凋亡作用。实验结果表明在无任何刺激剂的情况下,Jurkat和ACH2细胞的凋亡率不因细胞内PDCD2表达量的增加而改变。通过摸索FasL、TRAIL和TNF-α三种凋亡诱导剂刺激Jurkat、ACH2与HeLa细胞株的凋亡作用,发现Jurkat和ACH2细胞对TRAIL(25 ng/ml)刺激的凋亡作用最为敏感。进而,在TRAIL刺激下,与对照组细胞相比,高表达PDCD2基因的Jurkat和ACH2细胞凋亡率显著增高,有统计学差异(*P潜伏感染细胞中HIV病毒的释放。此外,本研究表明人PDCD2与猴PDCD2即使有12个氨基酸序列存在差异,同源性96.5%,但两者对TRAIL诱导的细胞凋亡作用无差异。接下来,我们也对PDCD2的C结构域在凋亡中发挥的作用进行了初步探究。在未刺激的条件下,人 PDCD2 全长及其剪切异构体 PDCD2(HS3)、PDCD2(HS4)、PDCD2(HS7)的过表达不会影响Jurkat/ACH2细胞的凋亡。但在TRAIL刺激下,PDCD2(HS3)不能有效诱导Jurkat/ACH2细胞的凋亡,说明完全缺失PDCD2结构域的蛋白分子不能发挥其促细胞凋亡作用。PDCD2(HS7)包含了 C结构域靠近信号肽第226至292号氨基酸序列,该剪切异构体的表达可以促进Jurkat/ACH2细胞的凋亡,其结果与全长PDCD2(H)所诱导的细胞凋亡一致。综上,本研究观察到PDCD2能在TRAIL刺激下促进T细胞和HIV潜伏感染T细胞的凋亡,同时能促进HIV潜伏感染细胞病毒的释放,提示PDCD2在诱导HIV潜伏感染细胞凋亡及病毒活化的过程中发挥重要作用。此外,PDCD2中C结构域的完全缺失会影响PDCD2发挥的促细胞凋亡作用,但C结构域包含的第226至292号氨基酸序列可使PDCD2恢复其促凋亡功能,提示该序列可能是决定PDCD2细胞凋亡作用的主要功能区域。

关键词：程序性细胞死亡2 T细胞 HIV-1 潜伏感染细胞凋亡剪切异构体

鲤疱疹病毒Ⅱ型培养条件及潜伏感染条件的探究

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鲤疱疹病毒Ⅱ型培养条件及潜伏感染条件的探究

作者：朱悦浙江海洋大学

学位级别：硕士

鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)能够引起感染宿主的造血器官坏死,传染性极高,流行情况遍及全球。该病毒主要危害金鱼、鲫鱼及其变种,对我国鲫鱼养殖业危害甚广,其潜伏特性对养殖业也具有巨大的潜在威胁。研究该病毒的... 详细信息

鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)能够引起感染宿主的造血器官坏死,传染性极高,流行情况遍及全球。该病毒主要危害金鱼、鲫鱼及其变种,对我国鲫鱼养殖业危害甚广,其潜伏特性对养殖业也具有巨大的潜在威胁。研究该病毒的保存条件及潜伏感染的条件对于病毒的基础研究和防控措施具有重大意义。本论文对CyHV-2毒株CNDF-TB2015的保存条件与增殖特征进行了研究,建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型荧光定量PCR检测方法、鲤疱疹病毒Ⅱ型潜伏感染鲫鱼模型,研究了鲤疱疹病毒Ⅱ型潜伏感染鲫鱼体内的病毒载量。1.CyHV-2毒株CNDF-TB2015的保存条件与增殖特征:为获取该病毒的培养特征和最佳保存条件,采用异育银鲫脊髓组织细胞系(CSC)培养该病毒,并对病毒的培养与保存条件、在CSC细胞和鲫鱼体内的增殖特征进行了研究。通过对不同培养温度(16℃、24℃、30℃)和吸附时长(20 min、40 min、60 min、80 min)条件下毒株CNDF-TB2015致细胞病变的比较,发现10TCID/mL病毒吸附20 min～40min,24℃培养4d可引起细胞明显病变,7d病变率可达80%,而30℃培养条件下仅出现少量病变,16℃无细胞病变,病毒吸附时长60min和80min出现细胞脱落,致使病毒感染失败;对浓度为10TCID/mL的病毒液在4℃、-20℃、-80℃和液氮中保存不同时间后进行病毒致细胞病变率测定,结果表明,在4℃保存21 d,在-80℃保存168 d,在液氮中保存6个月,病毒仍保持较高感染力,而-20℃保存7d便失去对CSC细胞的感染力;0.2 mL 10TCID/mL病毒液感染CSC细胞后在不同时间对病毒浓度进行测定,发现12 h内病毒增殖较为缓慢,12-96 h为对数增长期,96 h时病毒滴度和拷贝数分别达到最高值10TCID/mL、7.5×10copies/μg,96-120 h为病毒增殖的平台期,120 h后病毒浓度开始降低。而以10TCID/mL病毒液对鲫鱼进行注射感染,发现病毒感染鱼体后脾脏、肾脏病毒含量分别于第2d、第3d达到峰值,此后迅速降低。以上研究结果表明,CyHV-2 CNDF-TB2015毒株在CSC细胞中可高效稳定增殖,为CyHV-2疫苗制备提供了理想毒株。2.鲤疱疹病毒Ⅱ型荧光定量PCR检测方法的建立:根据CyHV-2 DNA的ORF2L基因序列合成引物和Taq Man探针,建立了CyHV-2荧光定量PCR检测方法,利用PCR技术扩增150bp的目的基因片段,克隆到p MD19-T载体上,结果显示,以重组质粒为标准品建立的标准曲线在3.52×10copies/μL～3.52×10copies/μL范围具有良好的线性关系,以质粒DNA起始浓度的对数值(x)为横坐标,以Ct值(y)为纵坐标得到标准曲线y=-3.4586x+37.798,相关系数R为0.995;其最低检出量为35copies。按10倍稀释法将病毒DNA模板稀释成10个浓度梯度,稀释倍数分别为10～10,分别用CyHV-2的ORF2L和DNA聚合酶的引物进行q PCR检测,结果表明ORF2L可检测最低浓度为10,聚合酶引物可检测最低浓度为10,因此ORF2L引物的检测灵敏度是聚合酶基因引物的10倍。3.鲤疱疹病毒Ⅱ型潜伏感染鲫鱼模型的建立:在不同规格鲫鱼(120g±20g,180g±20g,250g±20g)、不同攻毒浓度10(10TCID)、10(10TCID)、10(10TCID)、10(10TCID)、不同水温10±1℃、15±1℃、24±1℃、30±1℃条件下进行攻毒试验,统计鲫鱼的存活率并筛选潜伏模型建立条件;并用q PCR和RT-PCR检测各组织病毒复制及转录情况。结果显示,鲫鱼规格大于180g,感染CyHV-2后存活率较低;在10TCID/mL、10TCID/mL、10TCID/mL、10TCID/mL这四个攻毒浓度下,鲫鱼感染时浓度越低,鲫鱼存活率越高;四个攻毒浓度下,120g±20g规格的鲫鱼在10±1℃和30±1℃下感染CyHV-2后存活率100%,15±1℃下存活率为77.9%,24±1℃下存活率为37.5%。q PCR结果显示,15±1℃下所有组织病毒DNA均为阳性,RT-PCR均有一定数值,提示低水平复制,非潜伏状态,因此15℃下存在一定的发病率,不适合潜伏模型的建立。24±1℃下10TCID/mL、10TCID/mL、10TCID/mL组在28天内死亡率均75%以上,所有浓度下各组织病毒的DNA、RT-PCR结果均为阳性,各组织均有转录现象,因此24℃下也不适合潜伏感染模型的建立。各浓度组在10±1℃、30±1℃组下均未出现死亡现象,荧光定量PCR检测其每个浓度下组织内病毒DNA均为阳性,RT-PCR结果为阴性,说明鲫鱼体内病毒均处于潜伏状态,因此可在10±1℃低温、30±1℃高温下,

关键词：鲤疱疹Ⅱ型潜伏感染感染条件

PRDM1和GATA2基因mRNA作为活动性结核和潜伏感染鉴别诊断标志物的可能性研究

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实用医学杂志 2022年第13期38卷 1595-1598,1603页

作者：刘艳华王若杨秉芬曹志红翟斐孙雯娜苏瑾文俞珊程小星解放军总医院第八医学中心结核病医学部全军结核病防治重点实验室结核病诊疗新技术北京市重点实验室北京100091 解放军总医院第八医学中心结核病医学部结核科北京100091

目的活动性结核病的诊断仍然是结核病防治的重点和难点,差异表达基因有望成为结核病新的诊断靶标。本研究通过检测结核分枝杆菌不同感染状态下人外周血中PR/SET域1(PR/SET domain 1,PRDM1)和GATA结合蛋白2(GATA binding protein 2,GATA2... 详细信息

目的活动性结核病的诊断仍然是结核病防治的重点和难点,差异表达基因有望成为结核病新的诊断靶标。本研究通过检测结核分枝杆菌不同感染状态下人外周血中PR/SET域1(PR/SET domain 1,PRDM1)和GATA结合蛋白2(GATA binding protein 2,GATA2)基因的mRNA表达,分析其作为诊断标志物的能力。方法收集活动性结核病患者、结核分枝杆菌潜伏感染者和健康人外周血,荧光定量PCR检测外周血单个核细胞中PRDM1和GATA2的m RNA水平,分析各组受试者PRDM1和GATA2基因表达差异及其鉴别活动性结核和潜伏感染的诊断能力。结果活动性结核病患者外周血单个核细胞中PRDM1和GATA2的表达显著低于潜伏感染者和健康人(H=69.27,P潜伏感染的曲线下面积为0.8967,灵敏度为80.22%,特异度为87.1%。GATA2鉴别诊断活动性结核和潜伏感染的曲线下面积为0.8061,灵敏度为82.35%,特异度为70.97%。PRDM1和GATA2联合诊断活动性结核和潜伏感染的曲线下面积为0.935,诊断的灵敏度为76.9%,特异度为100%。结论外周血单个核细胞中PRDM1和GATA2的mRNA表达水平是鉴别活动性结核和潜伏感染者的潜在标志物,有助于活动性结核的辅助诊断。

关键词：活动性结核潜伏感染诊断标志物 PR/SET域1 GATA结合蛋白2

2016—2020年淄博市学生结核潜伏感染现状及预防性服药情况分析

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现代预防医学 2022年第11期49卷 1987-1991+1998页

作者：李源赵炫刘洁金瑾高风华淄博市疾病预防控制中心山东省公共卫生临床中心

目的了解学生结核潜伏感染状况及预防性服药情况，为学校结核病防控提供科学依据。方法收集“中国结核病管理信息”、“山东省学生健康体检管理系统”、结核病筛查年度报表数据，利用EpiData 3.1、 Excel 2016、SPSS 22.0软件统计分... 详细信息

目的了解学生结核潜伏感染状况及预防性服药情况，为学校结核病防控提供科学依据。方法收集“中国结核病管理信息”、“山东省学生健康体检管理系统”、结核病筛查年度报表数据，利用EpiData 3.1、 Excel 2016、SPSS 22.0软件统计分析。计数资料以“率”或“构成比”表示，采用χ~2检验进行比较。结果共筛查170 143名学生，PPD阳性率17.77%,各年份PPD阳性率差异具有统计学意义(χ~2=274.998,P<0.001);男性与女性阳性率和强阳性率差异比较均无统计学意义(χ~2=1.476,P=0.224;χ~2=0.120,P=0.729);寄宿与非寄宿阳性率和强阳性率差异均有统计学意义(χ~2=1 039.468,P<0.001;χ~2=219.721,P<0.001);不同学历及生源地学生各年份阳性率(χ~2=193.277,P<0.001;χ~2=443.039,P<0.001)与强阳性率(χ~2=20.693,P<0.001;χ~2=438.292,P<0.001)差异均具有统计学意义。预防性服药率5.75%,“担心药物不良反应”拒绝者55.34%。结论高中与大一新生是结核病筛查重点，对强阳性者要重点科普预防服药相关知识，提高学生对预防性服药接受度。

关键词：学生结核潜伏感染预防性服药

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伪狂犬病毒潜伏感染相关病毒因子研究进展

病毒学报 2021年第6期37卷 1515-1524页

作者：谷思睿赵军陈弟诗黄瑶王玉玲徐雷周莉媛朱玲徐志文四川农业大学动物生物技术中心成都611130 动物疫病与人类健康四川省重点实验室成都611130 四川省动物疫病预防控制中心成都610041

伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)属于α-疱疹病毒亚科,能够在猪体内建立并维持终身潜伏感染状态。潜伏感染的定期重新激活或间歇性活性循环给PRV疫病防控和净化带来巨大困难,给养猪业造成严重的经济损失。随着对α-疱疹病毒致病机... 详细信息

伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)属于α-疱疹病毒亚科,能够在猪体内建立并维持终身潜伏感染状态。潜伏感染的定期重新激活或间歇性活性循环给PRV疫病防控和净化带来巨大困难,给养猪业造成严重的经济损失。随着对α-疱疹病毒致病机制和潜伏感染机制的深入研究,近年来关于PRV潜伏感染相关转录本(Latencyassociated transcripts,LATs)研究增多,但由于病毒潜伏和激活过程涉及复杂的病毒与宿主相互作用关系,很多潜伏感染具体机制仍然不明确。因此本文重点讨论了近年来PRV潜伏感染相关病毒因子的研究进展,对PRV LAT的功能和其在潜伏感染中可能涉及的分子机制进行梳理;同时α-疱疹病毒各成员之间显著的同源性也为PRV潜伏感染和启动再激活因素的探究提供了新见解,以期为深入研究宿主抗PRV潜伏感染提供参考。

关键词：伪狂犬病毒潜伏感染立即早期基因潜伏感染相关转录本