鲤疱疹病毒Ⅱ型培养条件及潜伏感染条件的探究

作     者：朱悦 

作者单位：浙江海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：沈锦玉

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：鲤疱疹Ⅱ型 潜伏感染 感染条件 

摘      要：鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)能够引起感染宿主的造血器官坏死,传染性极高,流行情况遍及全球。该病毒主要危害金鱼、鲫鱼及其变种,对我国鲫鱼养殖业危害甚广,其潜伏特性对养殖业也具有巨大的潜在威胁。研究该病毒的保存条件及潜伏感染的条件对于病毒的基础研究和防控措施具有重大意义。本论文对CyHV-2毒株CNDF-TB2015的保存条件与增殖特征进行了研究,建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型荧光定量PCR检测方法、鲤疱疹病毒Ⅱ型潜伏感染鲫鱼模型,研究了鲤疱疹病毒Ⅱ型潜伏感染鲫鱼体内的病毒载量。1.CyHV-2毒株CNDF-TB2015的保存条件与增殖特征:为获取该病毒的培养特征和最佳保存条件,采用异育银鲫脊髓组织细胞系(CSC)培养该病毒,并对病毒的培养与保存条件、在CSC细胞和鲫鱼体内的增殖特征进行了研究。通过对不同培养温度(16℃、24℃、30℃)和吸附时长(20 min、40 min、60 min、80 min)条件下毒株CNDF-TB2015致细胞病变的比较,发现10TCID/mL病毒吸附20 min～40min,24℃培养4d可引起细胞明显病变,7d病变率可达80%,而30℃培养条件下仅出现少量病变,16℃无细胞病变,病毒吸附时长60min和80min出现细胞脱落,致使病毒感染失败;对浓度为10TCID/mL的病毒液在4℃、-20℃、-80℃和液氮中保存不同时间后进行病毒致细胞病变率测定,结果表明,在4℃保存21 d,在-80℃保存168 d,在液氮中保存6个月,病毒仍保持较高感染力,而-20℃保存7d便失去对CSC细胞的感染力;0.2 mL 10TCID/mL病毒液感染CSC细胞后在不同时间对病毒浓度进行测定,发现12 h内病毒增殖较为缓慢,12-96 h为对数增长期,96 h时病毒滴度和拷贝数分别达到最高值10TCID/mL、7.5×10copies/μg,96-120 h为病毒增殖的平台期,120 h后病毒浓度开始降低。而以10TCID/mL病毒液对鲫鱼进行注射感染,发现病毒感染鱼体后脾脏、肾脏病毒含量分别于第2d、第3d达到峰值,此后迅速降低。以上研究结果表明,CyHV-2 CNDF-TB2015毒株在CSC细胞中可高效稳定增殖,为CyHV-2疫苗制备提供了理想毒株。2.鲤疱疹病毒Ⅱ型荧光定量PCR检测方法的建立:根据CyHV-2 DNA的ORF2L基因序列合成引物和Taq Man探针,建立了CyHV-2荧光定量PCR检测方法,利用PCR技术扩增150bp的目的基因片段,克隆到p MD19-T载体上,结果显示,以重组质粒为标准品建立的标准曲线在3.52×10copies/μL～3.52×10copies/μL范围具有良好的线性关系,以质粒DNA起始浓度的对数值(x)为横坐标,以Ct值(y)为纵坐标得到标准曲线y=-3.4586x+37.798,相关系数R为0.995;其最低检出量为35copies。按10倍稀释法将病毒DNA模板稀释成10个浓度梯度,稀释倍数分别为10～10,分别用CyHV-2的ORF2L和DNA聚合酶的引物进行q PCR检测,结果表明ORF2L可检测最低浓度为10,聚合酶引物可检测最低浓度为10,因此ORF2L引物的检测灵敏度是聚合酶基因引物的10倍。3.鲤疱疹病毒Ⅱ型潜伏感染鲫鱼模型的建立:在不同规格鲫鱼(120g±20g,180g±20g,250g±20g)、不同攻毒浓度10(10TCID)、10(10TCID)、10(10TCID)、10(10TCID)、不同水温10±1℃、15±1℃、24±1℃、30±1℃条件下进行攻毒试验,统计鲫鱼的存活率并筛选潜伏模型建立条件;并用q PCR和RT-PCR检测各组织病毒复制及转录情况。结果显示,鲫鱼规格大于180g,感染CyHV-2后存活率较低;在10TCID/mL、10TCID/mL、10TCID/mL、10TCID/mL这四个攻毒浓度下,鲫鱼感染时浓度越低,鲫鱼存活率越高;四个攻毒浓度下,120g±20g规格的鲫鱼在10±1℃和30±1℃下感染CyHV-2后存活率100%,15±1℃下存活率为77.9%,24±1℃下存活率为37.5%。q PCR结果显示,15±1℃下所有组织病毒DNA均为阳性,RT-PCR均有一定数值,提示低水平复制,非潜伏状态,因此15℃下存在一定的发病率,不适合潜伏模型的建立。24±1℃下10TCID/mL、10TCID/mL、10TCID/mL组在28天内死亡率均75%以上,所有浓度下各组织病毒的DNA、RT-PCR结果均为阳性,各组织均有转录现象,因此24℃下也不适合潜伏感染模型的建立。各浓度组在10±1℃、30±1℃组下均未出现死亡现象,荧光定量PCR检测其每个浓度下组织内病毒DNA均为阳性,RT-PCR结果为阴性,说明鲫鱼体内病毒均处于潜伏状态,因此可在10±1℃低温、30±1℃高温下,病毒浓度在10TCID-10TCID区间内建立潜伏感染模型。4.鲤疱疹病毒Ⅱ型潜伏感染鲫鱼体内的病毒载量变化:攻毒感染鲫鱼后,分别在0d、3d、7d、14d、28d、60d、90d采集肝、脾、肾、鳃、肠、脑、血液,从血液中分离白细胞,提取DNA、RNA,通过荧光定量PCR检测病毒基因表达情况,测定潜伏感染状态下病毒的富集部位。通过荧光定量PCR对样品核酸的测定,得出结论,鲫鱼潜伏感染CyHV-2后,3天内脾、肝、肾组织病毒含量迅速上升,脾脏在第3天达到10copies/μg,肝脏第3天达到了10copies/μg,肾脏在第3天达到10copies/μg,3天后逐渐下降,7天后下降趋势减缓,28天后病毒含量维持在一定水平,变化趋势不大;脑部组织病毒含量第7天最高值达到10copies/μg,下降到28天后趋势减缓。肠、鳃内病毒载量持续增长到第7天,第7天分别达到最高值10copies/μg、10copies/μg,7天后缓慢下降,28天后,各组织病毒载量已趋于稳定,低水平存在组织中;血液中白细胞的病毒含量相对较低,波动在10～10copies/μg之间。从各组织内病毒载量的变化趋势来看,10℃和30℃潜伏感染状态下,病毒变化规律相似。