PDCD2及其剪切异构体在T细胞及HIV潜伏感染T细胞中的凋亡作用

作     者：余雯惠 

作者单位：北京协和医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：薛婧

授予年度：2022年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：程序性细胞死亡2 T细胞 HIV-1 潜伏感染 细胞凋亡 剪切异构体 

摘      要：T细胞是人体重要的一类免疫细胞,在抵抗病原微生物以及维持机体的正常免疫功能中发挥重要作用。CD4+T细胞是人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染的主要靶细胞,随着疾病进展,机体的CD4+T细胞会大量减少,以致引发一系列的机会性感染,最终进展为艾滋病(Acquired immune deficiency syndrome,AIDS)。HIV 能整合到细胞的基因组中,以 HIV前病毒DNA的形式藏匿在组织细胞内从而不易被体内的免疫系统所识别,最终形成病毒潜伏库,HIV潜伏库是当今艾滋病难以实现治愈的重要障碍。程序性细胞死亡蛋白 2(Programmed cell death protein 2,PDCD2)是一种高度保守的真核蛋白,广泛分布于人体的多种组织,在细胞凋亡中发挥重要的调节作用。PDCD2存在多种剪切形式,其不同剪切异构体的功能机制仍不明确,而且PDCD2及其剪切异构体对T细胞以及HIV潜伏感染T细胞的凋亡作用机制仍需深入探讨。本研究中,我们构建了含有人PDCD2即PDCD2(H)、猴PDCD2即PDCD2(RM)、三种剪切形式包括PDCD2(HS3)、PDCD2(HS4)、PDCD2(HS7)基因的重组慢病毒表达质粒,通过慢病毒包装及感染的方式在T淋巴细胞系来源的Jurkat和HIV潜伏感染细胞ACH2中分别过表达这些基因,建立了多个稳定细胞株,研究PDCD2及其剪切异构体在凋亡诱导剂刺激下的细胞凋亡作用。实验结果表明在无任何刺激剂的情况下,Jurkat和ACH2细胞的凋亡率不因细胞内PDCD2表达量的增加而改变。通过摸索FasL、TRAIL和TNF-α三种凋亡诱导剂刺激Jurkat、ACH2与HeLa细胞株的凋亡作用,发现Jurkat和ACH2细胞对TRAIL(25 ng/ml)刺激的凋亡作用最为敏感。进而,在TRAIL刺激下,与对照组细胞相比,高表达PDCD2基因的Jurkat和ACH2细胞凋亡率显著增高,有统计学差异(*P0.05)。此外,在TRAIL刺激下,高表达PDCD2基因的ACH2细胞上清中HIV病毒载量显著升高(*P0.05),说明PDCD2的高表达可以促进TRAIL介导下HIV潜伏感染细胞中HIV病毒的释放。此外,本研究表明人PDCD2与猴PDCD2即使有12个氨基酸序列存在差异,同源性96.5%,但两者对TRAIL诱导的细胞凋亡作用无差异。接下来,我们也对PDCD2的C结构域在凋亡中发挥的作用进行了初步探究。在未刺激的条件下,人 PDCD2 全长及其剪切异构体 PDCD2(HS3)、PDCD2(HS4)、PDCD2(HS7)的过表达不会影响Jurkat/ACH2细胞的凋亡。但在TRAIL刺激下,PDCD2(HS3)不能有效诱导Jurkat/ACH2细胞的凋亡,说明完全缺失PDCD2结构域的蛋白分子不能发挥其促细胞凋亡作用。PDCD2(HS7)包含了 C结构域靠近信号肽第226至292号氨基酸序列,该剪切异构体的表达可以促进Jurkat/ACH2细胞的凋亡,其结果与全长PDCD2(H)所诱导的细胞凋亡一致。综上,本研究观察到PDCD2能在TRAIL刺激下促进T细胞和HIV潜伏感染T细胞的凋亡,同时能促进HIV潜伏感染细胞病毒的释放,提示PDCD2在诱导HIV潜伏感染细胞凋亡及病毒活化的过程中发挥重要作用。此外,PDCD2中C结构域的完全缺失会影响PDCD2发挥的促细胞凋亡作用,但C结构域包含的第226至292号氨基酸序列可使PDCD2恢复其促凋亡功能,提示该序列可能是决定PDCD2细胞凋亡作用的主要功能区域。