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野生与养殖条件下香港牡蛎和咬齿牡蛎寄生派琴虫感染差异研究

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南方水产科学 2024年第6期20卷 169-175页

作者：庄梦浩付胜利姚托卢洁姜皓译王玉香郝耀彤叶灵通河北农业大学海洋学院河北秦皇岛066000 中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部水产品加工重点实验室/农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室广东广州510300 三亚热带水产研究院海南三亚572426 广东海洋大学水产学院广东湛江524088

人类活动改变了牡蛎的生长和发育环境,也因此影响着其体内寄生虫的繁殖,促进了寄生虫的扩散与传播。为评估人类活动对香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)和咬齿牡蛎(Saccostrea mordax)感染派琴虫(Perkinsus spp.)的影响,分别采集了... 详细信息

人类活动改变了牡蛎的生长和发育环境,也因此影响着其体内寄生虫的繁殖,促进了寄生虫的扩散与传播。为评估人类活动对香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)和咬齿牡蛎(Saccostrea mordax)感染派琴虫(Perkinsus spp.)的影响,分别采集了华南沿海8个地区的6个野生牡蛎种群和4个养殖牡蛎种群,分析了野生和养殖条件下派琴虫的感染率与感染丰度差异。结果显示,养殖香港牡蛎的派琴虫平均感染率为(61.25±13.30)%,与野生香港牡蛎差异不显著,但两者均显著高于野生咬齿牡蛎[(13.75±5.45)%]。不同地区间养殖香港牡蛎的派琴虫感染率差异显著,而野生香港牡蛎和野生咬齿牡蛎的派琴虫感染率差异均不显著。野生香港牡蛎派琴虫平均感染丰度为[(1144.79±295.85)个·g^(-1)],与野生咬齿牡蛎差异不显著,但两者均显著低于养殖香港牡蛎[(14668.08±8379.21)个·g^(-1)]。不同地区间,养殖香港牡蛎、野生香港牡蛎、野生咬齿牡蛎的派琴虫感染丰度均差异不显著。香港牡蛎转运养殖促进了不同地区间派琴虫的传播,人为干预的养殖与野生的环境差异造成了派琴虫的感染丰度显著变化。首次在咬齿牡蛎上发现了派琴虫感染,说明派琴虫的传播范围广、传播能力强。咬齿牡蛎特殊的附着生活方式降低了派琴虫的感染风险。由于野生香港牡蛎的感染丰度低,将其亲本用于育苗可降低派琴虫的垂直和水平传播风险。

关键词：派琴虫香港牡蛎咬齿牡蛎养殖种群野生种群

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贝类派琴虫和单孢子虫二重荧光定量PCR方法的建立

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中国兽医学报 2010年第7期30卷 917-921页

作者：谢丽基谢芝勋庞耀珊刘加波邓显文谢志勤广西兽医研究所广西南宁530001

根据基因库中派琴虫和单孢子虫基因组的保守序列,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能够同时检测派琴虫和单孢子虫的二重荧光定量PCR方法。该方法特异性好,对派琴虫和单孢子... 详细信息

根据基因库中派琴虫和单孢子虫基因组的保守序列,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能够同时检测派琴虫和单孢子虫的二重荧光定量PCR方法。该方法特异性好,对派琴虫和单孢子虫的检测敏感性分别达到400和40个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对派琴虫和单孢子虫不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测这2个原虫。对广西沿海的49份贻贝病料进行检测,结果派琴虫阳性率为16.3%,检测的派琴虫含量为2.38×106～9.21×102拷贝/μL;提示派琴虫广泛存在于中国南方沿海的养殖贝类中,建立的荧光定量PCR方法可以用于贝类派琴虫的临床快速检测。该方法对单孢子虫检测的敏感性比派琴虫高,而49份贻贝病料未检出单孢子虫,提示需要进行更多临床样品的检测。

关键词：派琴虫单孢子虫二重荧光定量PCR

同时检测贝类派琴虫和包纳米虫的双重LAMP方法的建立

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中国畜牧兽医 2015年第8期42卷 1935-1942页

作者：王彩霞冯春燕王巧黎袁向芬邓俊花吕继洲吴绍强中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所北京100029 青岛市中心医疗集团青岛266005

为满足贝类寄生虫快速检测需求,本研究根据GenBank中发布的派琴虫ITS序列和包纳米虫18SrRNA序列的保守区域分别设计LAMP扩增引物,分别建立了两种寄生虫的单重LAMP检测方法,进一步对反应体系进行优化,组装成两种寄生虫的双重LAMP方法,同... 详细信息

为满足贝类寄生虫快速检测需求,本研究根据GenBank中发布的派琴虫ITS序列和包纳米虫18SrRNA序列的保守区域分别设计LAMP扩增引物,分别建立了两种寄生虫的单重LAMP检测方法,进一步对反应体系进行优化,组装成两种寄生虫的双重LAMP方法,同时还进行了特异性检测和敏感性检测,并通过对扩增产物进行限制性内切酶酶切检验双重LAMP方法的准确性。结果表明本研究建立的贝类寄生虫双重LAMP方法具有较好的特异性,检测派琴虫时的最低检测限为10拷贝/μL质粒DNA,检测包纳米虫时的最低检测限为100拷贝/μL质粒DNA,同时酶切试验也验证了双重LAMP检测结果的准确性。对随机采自东海和黄海的20份菲律宾蛤仔和10份美国进口牡蛎的检测结果显示,该双重LAMP方法在口岸检疫工作中可以作为派琴虫和包纳米虫的快速检测方法。

关键词：贝类寄生虫病环介导等温扩增反应(LAMP) 检测派琴虫包纳米虫

贝类派琴虫实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

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渔业科学进展 2009年第5期30卷 58-63页

作者：吴绍强李海艳林祥梅郑腾李西峰刘建梅琳韩雪清贾广乐中国检验检疫科学研究院北京100029 内蒙古农业大学呼和浩特010018 福建出入境检验检疫局福州350003 黄岛出入境检验检疫局青岛266555

选择派琴虫保守的核糖体DNAITS-2区域设计引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化,建立了实时荧光定量PCR检测派琴虫的方法。所构建方法检测质粒模板DNA的动态范围为2.6×101～2.6×107拷贝,敏感度可检测到26拷贝质粒DNA,... 详细信息

选择派琴虫保守的核糖体DNAITS-2区域设计引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化,建立了实时荧光定量PCR检测派琴虫的方法。所构建方法检测质粒模板DNA的动态范围为2.6×101～2.6×107拷贝,敏感度可检测到26拷贝质粒DNA,而且与包拉米原虫、隐孢子虫等其他寄生性原虫无交叉反应,也不受贝类组织DNA的干扰。利用本研究所建立的方法对来自我国山东、福建等不同沿海海域的30份贝类样品进行检测,检出阳性样品3份。研究表明,本研究所构建的派琴虫实时荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏和特异等优点,可满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需要。

关键词：派琴虫贝类实时荧光PCR 检测

贝类派琴虫二温式PCR检测方法的建立及初步应用

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中国兽医杂志 2013年第4期49卷 63-65页

作者：谢丽基谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢志勤范晴广西壮族自治区兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室广西南宁530001

根据GenBank中派琴虫的基因保守序列,设计了一对特异性引物,通过对二温式PCR扩增条件的优化,研究建立了检测贝类派琴虫的二温式PCR方法。该方法对派琴虫模板进行扩增,得到与试验设计相符的276bp的特异性扩增带,而对马尔太虫、单孢子虫... 详细信息

根据GenBank中派琴虫的基因保守序列,设计了一对特异性引物,通过对二温式PCR扩增条件的优化,研究建立了检测贝类派琴虫的二温式PCR方法。该方法对派琴虫模板进行扩增,得到与试验设计相符的276bp的特异性扩增带,而对马尔太虫、单孢子虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等病原体的扩增,结果全为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到1fg的派琴虫质粒DNA。用该二温式PCR对贝类样品进行检测,结果从广西的牡蛎检出派琴虫27份,连云港的菲律宾蛤仔检出派琴虫12份,温州的溢蛏中检出6份,结果提示,建立的半套式PCR方法可以用于贝类派琴虫的临床快速检测。

关键词：贝类派琴虫二温式PCR

贝类派琴虫和单孢子虫双重PCR检测方法的建立

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畜牧与兽医 2010年第1期42卷 8-11页

作者：谢丽基谢芝勋庞耀珊刘加波邓显文谢志勤广西兽医研究所广西南宁530001

根据基因库中派琴虫和单孢子虫的基因序列,分别设计了2对特异性引物,通过对双重PCR扩增条件的优化,建立了可同时检测鉴别这2种原虫的双重PCR。对同一样品中的派琴虫和单孢子虫模板进行扩增,结果均同时得到2条大小与试验设计相符的596bp... 详细信息

根据基因库中派琴虫和单孢子虫的基因序列,分别设计了2对特异性引物,通过对双重PCR扩增条件的优化,建立了可同时检测鉴别这2种原虫的双重PCR。对同一样品中的派琴虫和单孢子虫模板进行扩增,结果均同时得到2条大小与试验设计相符的596bp(派琴虫)和244bp(单孢子虫)的特异性扩增带,对其他贝类病原核酸的扩增结果为阴性。敏感性试验结果表明,最低能检测到10pg的派琴虫和单孢子虫DNA。用该双重PCR对广西沿海的104份牡蛎、49份贻贝和20份文蛤病料进行检测,派琴虫的阳性率分别为14.6%,10.6%和15%,而未检出单孢子虫,结果提示派琴虫广泛存在于中国南方沿海的养殖贝类中,建立的PCR方法可以用于贝类派琴虫和单孢子虫的临床快速检测。

关键词：派琴虫单孢子虫双重PCR

贝类奥尔森派琴虫可视化LAMP检测技术的建立与应用

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西南农业学报 2012年第1期25卷 302-305,F0003页

作者：庞耀珊谢芝勋谢丽基谢志勤邓显文刘加波彭宜范晴广西壮族自治区兽医研究所、广西畜禽疫苗新技术重点实验室广西南宁530001

根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理,针对奥尔森派琴虫(Perkinsus olseni)的5.8 S核糖体RNA与内转录2间隔区序列,设计了6条特异性LAMP扩增引物,分别为两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。通过对反应条件的优化,建... 详细信息

根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理,针对奥尔森派琴虫(Perkinsus olseni)的5.8 S核糖体RNA与内转录2间隔区序列,设计了6条特异性LAMP扩增引物,分别为两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。通过对反应条件的优化,建立了一种适用于贝类奥尔森派琴虫的可视化LAMP检测技术。该技术只对奥尔森派琴虫发生扩增反应,产生黄绿色荧光扩增产物,对其他对照DNA样品无扩增反应,不产生黄绿色荧光。对F3和B3外引物扩增产物进行测序分析,其序列与Gen-Bank中奥尔森派琴虫序列一致,检测结果具有高度特异性。对奥尔森派琴虫质粒DNA的最低检测量为100 fg。用该项LAMP技术与OIE公布的派琴虫PCR检测技术分别对50份分别来自华东及华南沿海地区的牡蛎样品进行检测,同时对PCR阳性样品进行测序分析。结果 LAMP检测到2份奥尔森派琴虫,PCR方法检测到9份派琴虫。测序分析结果表明,PCR方法检测到的9份派琴虫阳性样品中有2份为奥尔森派琴虫,其结果与LAMP检测结果相符,说明该技术适用于贝类样品奥尔森派琴虫的检测。

关键词：派琴虫贝类 LAMP 荧光反应检测

贝类派琴虫半套式PCR检测方法的建立及初步应用

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广东农业科学 2012年第21期39卷 165-167页

作者：谢丽基谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢志勤范晴广西壮族自治区兽医研究所/广西畜禽疫苗新技术重点实验室广西南宁530001

根据GenBank中派琴虫(Perkinsus sp.)的基因组序列,设计了3条特异性引物Perkinsus303-1、Perkinsus303-2和Perkinsus209-1,建立了检测贝类派琴虫的半套式PCR方法。该方法对派琴虫检测得到209 bp的特异性扩增带,检测灵敏度达到0.01 fg的... 详细信息

根据GenBank中派琴虫(Perkinsus sp.)的基因组序列,设计了3条特异性引物Perkinsus303-1、Perkinsus303-2和Perkinsus209-1,建立了检测贝类派琴虫的半套式PCR方法。该方法对派琴虫检测得到209 bp的特异性扩增带,检测灵敏度达到0.01 fg的派琴虫质粒DNA。用该半套式PCR对临床样品进行检测,结果表明广西牡蛎、连云港的菲律宾蛤仔和温州溢蛏存在派琴虫感染,说明建立的半套式PCR方法可以用于贝类派琴虫的临床快速检测。

关键词：贝类派琴虫半套式PCR

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贝类派琴虫PCR检测方法的建立及初步应用

渔业科学进展 2011年第1期32卷 82-85页

作者：谢丽基谢芝勋庞耀珊刘加波邓显文谢志勤广西兽医研究所南宁530001

根据派琴虫的基因保守序列设计了特异性引物,对派琴虫的DNA进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明,扩增大小为596bp,与预期扩增序列同源性为99.8%。该PCR方法检测灵敏度高,最低可检测1pg的派琴虫DNA;特异性强,对荧光假... 详细信息

根据派琴虫的基因保守序列设计了特异性引物,对派琴虫的DNA进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明,扩增大小为596bp,与预期扩增序列同源性为99.8%。该PCR方法检测灵敏度高,最低可检测1pg的派琴虫DNA;特异性强,对荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌、葡萄球菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、诺瓦克样病毒等贝类病原体的扩增均为阴性。用该PCR技术对广西沿海的104份牡蛎、49份贻贝和20份文蛤病料进行检测,阳性率分别为14.6%、10.6%和15.0%。结果显示,派琴虫广泛存在于中国南方沿海的养殖贝类中,建立的PCR方法可用于贝类派琴虫的临床快速检测。

关键词：派琴虫 PCR 应用