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手霉素通过线粒体凋亡途径诱导U937和HL-60细胞凋亡

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中华血液学杂志 2007年第6期28卷 404-406页

作者：佘妙容李劲高杜欣林伟牛新青郭坤元广东省人民医院血液科广州510080 中山大学附属第二医院肾内科南方医科大学附属珠江医院血液内科

目的研究法尼酰基转移酶抑制剂手霉素(Manumycin)诱导白血病细胞凋亡的机制。方法用2 μmol/L 手霉素处理白血病细胞系 U937和 HL-60细胞不同时间,用流式细胞术检测细胞凋亡。免疫印迹技术检测细胞色素 C、caspase9、caspase8、caspase... 详细信息

目的研究法尼酰基转移酶抑制剂手霉素(Manumycin)诱导白血病细胞凋亡的机制。方法用2 μmol/L 手霉素处理白血病细胞系 U937和 HL-60细胞不同时间,用流式细胞术检测细胞凋亡。免疫印迹技术检测细胞色素 C、caspase9、caspase8、caspase3的表达。用荧光染料 JC-1检测法测定线粒体膜电位(△ψm),并用 caspase 抑制剂 Z-VAD-fmk 阻断 caspase 的活化,探讨 caspase 在手霉素诱导白血病细胞凋亡中的作用。结果 2 μmol/L 手霉素处理 U937和 HL-60细胞16 h,△ψm显著下降,相对值分别是0.51±0.07和0.41±0.06(P手霉素诱导细胞色素 C 从线粒体释放到细胞质,激活 caspase-9、caspase8和 caspase-3。50 μmol/L 的 Z-VAD-fmk 可完全阻断 caspase 激活,但仅部分阻断手霉素诱导的 U937和 HL-60细胞凋亡,细胞凋亡率分别减少51.69%和56.47%。结论手霉素通过线粒体途径诱导 U937和 HL-60细胞凋亡。

关键词：细胞凋亡细胞系,U937 细胞系,HL-60 手霉素

手霉素对人卵巢癌3AO细胞增殖和凋亡的影响

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肿瘤 2010年第8期30卷 651-655页

作者：张正茂顾来梅刘洁张超张风华康山单保恩王士杰河北医科大学第四医院妇产科河北医科大学第四医院科研中心石家庄050011 河北省人民医院外科石家庄050026

目的:探讨手霉素对人卵巢癌3AO细胞体外增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法:MTT法检测手霉素对3AO细胞的增殖抑制作用;Giemsa染色、透射电子显微镜下观察及FCM分析手霉素对3AO细胞的凋亡诱导作用;FCM检测手霉素对3AO细胞ras、sur... 详细信息

目的:探讨手霉素对人卵巢癌3AO细胞体外增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法:MTT法检测手霉素对3AO细胞的增殖抑制作用;Giemsa染色、透射电子显微镜下观察及FCM分析手霉素对3AO细胞的凋亡诱导作用;FCM检测手霉素对3AO细胞ras、survivin和核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)(p65)蛋白表达的影响。结果:手霉素能显著抑制3AO细胞的增殖(P手霉素浓度的增加和作用时间的延长而增强。Giemsa染色和透射电子显微镜下观察发现,手霉素可诱导3AO细胞出现典型的凋亡形态学变化及超微结构改变。FCM分析结果显示,与对照组相比,手霉素诱导3AO细胞凋亡率明显增加(P手霉素可明显抑制人卵巢癌3AO细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与下调细胞ras、NF-κB(p65)和survivin蛋白的表达有关。

关键词：卵巢肿瘤基因表达细胞凋亡手霉素细胞 3AO

手霉素对白血病干细胞和骨髓干细胞的细胞毒作用

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中国老年学杂志 2010年第16期30卷 2257-2258页

作者：姜振宇马宁张彦东姚程吉林大学第一医院风湿科吉林长春130021 吉林大学第一医院血液肿瘤科

目的探讨手霉素对白血病干细胞(LSC)的细胞毒作用。方法采用MTT法检测手霉素对LSC的细胞增殖抑制作用,采用Annex-inⅤ-FITC法检测LSC细胞凋亡情况并采用流式细胞术分析细胞周期。结果随着手霉素浓度的增高,LSC细胞增生抑制率明显增高,... 详细信息

目的探讨手霉素对白血病干细胞(LSC)的细胞毒作用。方法采用MTT法检测手霉素对LSC的细胞增殖抑制作用,采用Annex-inⅤ-FITC法检测LSC细胞凋亡情况并采用流式细胞术分析细胞周期。结果随着手霉素浓度的增高,LSC细胞增生抑制率明显增高,细胞凋亡率也逐渐增高,且阻滞于G2/M期的细胞比率明显增加。结论手霉素通过阻滞LSC于G2/M期,促进凋亡而抑制其增长,而对正常造血干细胞(HSC)无细胞毒作用。

关键词：法尼基转移酶抑制剂手霉素白血病干细胞细胞增生细胞凋亡

甲氧胺联合手霉素对白血病U937细胞凋亡的影响

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癌症 2008年第8期27卷 835-839页

作者：佘妙容郭坤元牛新清卢晓珣南方医科大学珠江医院血液内科广东广州510282

背景与目的:DNA损伤修复对细胞生存很重要。我们既往的研究发现手霉素可诱导肿瘤细胞出现DNA损害反应。因此,碱基切除修复抑制剂甲氧胺(methoxyamine)有可能增强手霉素(manumycin)的抗肿瘤作用。为此,本实验研究甲氧胺对手霉素诱导白血... 详细信息

背景与目的:DNA损伤修复对细胞生存很重要。我们既往的研究发现手霉素可诱导肿瘤细胞出现DNA损害反应。因此,碱基切除修复抑制剂甲氧胺(methoxyamine)有可能增强手霉素(manumycin)的抗肿瘤作用。为此,本实验研究甲氧胺对手霉素诱导白血病细胞凋亡的影响,探讨联合甲氧胺和手霉素诱导白血病细胞凋亡过程中线粒体凋亡途径的变化。方法:不同浓度手霉素和甲氧胺处理U937细胞48h后,MTT细胞毒性测定U937细胞存活率,软琼脂法检测细胞的克隆形成。应用流式细胞术检测细胞凋亡。免疫印迹技术检测细胞色素C、Caspase-9、聚腺苷核糖聚合酶(poly-adenosyl ribose polymerase,PARP)的表达。中位效应方法评价两药的相互作用。结果:甲氧胺使手霉素的剂量反应曲线向左边移动,结合指数(CI)手霉素、5mmol/L甲氧胺和联合两药处理U937细胞,相对于对照组的克隆形成分别是0.3641±0.0463,0.7541±0.0379,0.0473±0.0024(联合用药组与对照组、手霉素组或甲氧胺组相比,P手霉素组或甲氧胺组相比,差异有统计学意义(P手霉素增强细胞色素C从线粒体释放到细胞浆,Caspase-9激活,PARP特异性裂解。结论:甲氧胺增强手霉素通过线粒体凋亡途径诱导U937细胞凋亡,提示甲氧胺联合FTIs和DNA修复抑制剂治疗白血病的可能性。

关键词：白血病法尼基转移酶抑制剂甲氧胺手霉素碱基切除修复抑制剂 U937细胞凋亡

氧化还原状态的改变控制手霉素诱导HL-60白血病细胞凋亡

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中国药理学通报 2008年第6期24卷 772-777页

作者：佘妙容郭坤元牛新清卢晓珣涂三芳南方医科大学珠江医院血液内科广东广州510282

目的研究手霉素对HL-60白血病细胞的作用,探讨其作用机制,主要是线粒体的改变。方法使用人的白血病细胞株HL-60细胞。MTT细胞毒性测定评价对白血病细胞的作用,使用Annexin V和一氧化氮(nitric oxide,NO)染料标记细胞,应用流式细胞仪术... 详细信息

目的研究手霉素对HL-60白血病细胞的作用,探讨其作用机制,主要是线粒体的改变。方法使用人的白血病细胞株HL-60细胞。MTT细胞毒性测定评价对白血病细胞的作用,使用Annexin V和一氧化氮(nitric oxide,NO)染料标记细胞,应用流式细胞仪术检测细胞内NO生成和细胞凋亡。细胞内超氧阴离子通过二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)测定。应用化学发光法测定超氧歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性。采用荧光法测定谷胱甘肽(glutathi-one,GSH),萤光素-萤光素酶发光法测定ATP含量。免疫印迹技术检测细胞色素C和Mn-SOD的表达。结果手霉素引起HL-60细胞活性的下降,且呈剂量依赖性。手霉素诱导产生反应性氧基(reactive oxygen species,ROS):NO和超氧阴离子,降低GSH,但不影响SOD。手霉素诱导线粒体降低细胞ATP的含量,线粒体肿胀和细胞色素C从线粒体释放到细胞质。手霉素诱导的凋亡与ROS的增加有关。用N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)抑制ROS可保护HL-60细胞逃避手霉素的细胞毒作用和避免手霉素诱导的凋亡。结论细胞内ROS的产生对手霉素的细胞毒作用起非常重要的作用。手霉素通过包括上游ROS产生,线粒体形态改变和细胞色素C释放的线粒体途径,诱导白血病细胞凋亡。

关键词：白血病凋亡手霉素反应性氧基一氧化氮超氧阴离子线粒体超氧歧化酶

手霉素通过上调P53诱导22Rv1前列腺癌细胞凋亡

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实用医学杂志 2018年第11期34卷 1812-1815页

作者：李劲高陈景佘妙容中山大学孙逸仙纪念医院肾内科广州510120 广东省人民医院广东省医学科学院医学研究部广州510080 广东省人民医院广东省医学科学院血液科广州510080

目的探讨手霉素对前列腺癌(prostate cancer,PC)细胞株22Rv1细胞的作用及其机制。方法使用MTT细胞毒性测定法评价人22Rv1细胞的活性,使用Annexin v和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染料标记细胞,应用流式细胞术检测细胞凋亡。采用免疫... 详细信息

目的探讨手霉素对前列腺癌(prostate cancer,PC)细胞株22Rv1细胞的作用及其机制。方法使用MTT细胞毒性测定法评价人22Rv1细胞的活性,使用Annexin v和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染料标记细胞,应用流式细胞术检测细胞凋亡。采用免疫印迹技术检测Caspase-3、H2AX和P53蛋白的表达。结果手霉素有效杀伤前列腺癌22Rv1细胞,随着手霉素剂量的增加,细胞活性逐渐下降。手霉素能诱导22Rv1细胞凋亡,早期凋亡率和晚期凋亡率均增加。手霉素通过caspase途径有效诱导22Rv1细胞凋亡。同时手霉素快速增加22Rv1细胞H2AX磷酸化和上调P53的表达。结论手霉素通过上调P53的表达和激活H2AX诱导前列腺癌细胞凋亡,杀伤前列腺癌细胞。

关键词：前列腺癌凋亡手霉素 H2AX P53

手霉素对甲状腺癌KAT-18细胞的作用及其机制

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实用医学杂志 2016年第15期32卷 2426-2429页

作者：李劲高黄晖婷李倩宛霞佘妙容中山大学孙逸仙纪念医院肾内科广州市510120 广东省人民医院广东省医学科学院血液科广州市510080

目的:探讨手霉素对甲状腺未分化癌KAT-18细胞株的作用及其机制。方法:使用SRB细胞毒性测定法评价KAT-18细胞的活性,使用Annexin v和一氧化氮(NO)染料标记细胞,应用流式细胞术检测细胞内NO生成和细胞凋亡,二氢乙啶(DHE)方法测定细胞内超... 详细信息

目的:探讨手霉素对甲状腺未分化癌KAT-18细胞株的作用及其机制。方法:使用SRB细胞毒性测定法评价KAT-18细胞的活性,使用Annexin v和一氧化氮(NO)染料标记细胞,应用流式细胞术检测细胞内NO生成和细胞凋亡,二氢乙啶(DHE)方法测定细胞内超氧阴离子。应用化学发光法测定超氧歧化酶(SOD)活性,Mn-SOD的表达采用免疫印迹技术检测。谷胱甘肽(GSH)含量采用荧光法测定。结果:手霉素有效杀伤KAT-18细胞,随着手霉素剂量的增加,细胞活性逐渐下降。手霉素诱导产生NO和超氧阴离子,降低GSH,但不影响Mn-SOD的蛋白表达和6 h的SOD活性,但24 h的SOD活性代偿性增加。手霉素诱导的凋亡与NO和超氧阴离子增加及GSH下降有关。用N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)抑制NO和超氧阴离子产生,提高GSH可减少手霉素诱导KAT-18细胞凋亡,从而逃避细胞被手霉素杀伤。结论:手霉素通过细胞内NO和超氧阴离子的产生诱导甲状腺癌细胞凋亡,杀伤甲状腺癌细胞。

关键词：甲状腺未分化癌手霉素凋亡反应性氧基谷胱甘肽超氧歧化酶

手霉素通过阻断PI3K／Akt信号通路诱导U937白血病细胞凋亡

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实用医学杂志 2017年第7期33卷 1066-1069页

作者：黄晖婷李劲高肖定璋陈景佘妙容南方医科大学广州市510515 广东省人民医院广东省医学科学院血液科广州市510080 中山大学孙逸仙纪念医院肾内科广州市510120 广东省人民医院病理生理研究室广州市510080

目的:探讨手霉素对U937白血病细胞的作用及其机制。方法:2μmol/L的手霉素处理U937白血病细胞不同时间,分别使用Annexin V/PI试剂及ROS检测试剂标记细胞后,应用流式细胞术检测细胞凋亡及细胞内ROS生成,免疫印迹术检测PI3K、P-Akt、Akt... 详细信息

目的:探讨手霉素对U937白血病细胞的作用及其机制。方法:2μmol/L的手霉素处理U937白血病细胞不同时间,分别使用Annexin V/PI试剂及ROS检测试剂标记细胞后,应用流式细胞术检测细胞凋亡及细胞内ROS生成,免疫印迹术检测PI3K、P-Akt、Akt等蛋白的表达。结果:与0 h对照组相比,随着处理时间的延长,手霉素诱导的U937细胞凋亡(P手霉素对U937细胞内PI3K/Akt信号通路的抑制及手霉素诱导的U937细胞凋亡。结论:手霉素通过诱导ROS产生进而抑制PI3K/Akt信号通路活化来诱导U937细胞凋亡。

关键词：手霉素 U937细胞 ROS 凋亡 P13K/Akt信号通路

手霉素通过诱导ROS生成逆转白血病干细胞对allo-NK细胞的杀伤抵抗

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手霉素通过诱导ROS生成逆转白血病干细胞对allo-NK细胞的杀伤抵抗

作者：黄晖婷南方医科大学

学位级别：硕士

背景与目的急性髓性白血病(Acute myeloid Leukemia,AML)是起源于骨髓造血干细胞的恶性疾病,约占成人急性白血病(Acute Leukemia,AL)的80%。近年来,随着联合化疗和异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)的不断发展明显改善了 AML病人的疗效,患者的完全缓解(complete remission,CR)率和无病生存率(disease free survival,DFS)都显著提高,但仍然有15%～25%的患者对化疗或者免疫治疗抵抗,超过60%的患者最终复发死亡。AML难治复发的根本原因是白血病干细胞(Leukemic stem cells,LSCs)的存在,LSCs对常规化疗药物耐药且对allo-HSCT后起关键杀伤作用的同种异体反应性自然杀伤细胞(allo-reactionNK,allo-NK)抵抗,残存的LSCs最终导致AML复发。因此,我们迫切需要新的治疗方法逆转LSCs的耐药和对allo-NK细胞杀伤抵抗,清除LSCs,最终治愈AML。Allo-NK细胞是机体固有免疫系统的主要成分之一,通过表达活化性受体和抑制性受体来识别异常和正常组织细胞。allo-NK细胞对包括白血病在内的多种肿瘤细胞,均有杀伤作用。NK细胞通过其表面的NKG2D和肿瘤细胞表面表达的NKG2D配体结合而激活,激活后的NK细胞能分泌穿孔素和颗粒酶来溶解肿瘤细胞;同时Allo-NK细胞表面表达的TRAIL和FasL,能和肿瘤细胞表面的DR4/5以及Fas结合,通过外源性凋亡途径诱导肿瘤细胞凋亡。allo-NK细胞对白血病细胞的杀伤活性受NKG2DL表达水平的影响,而白血病细胞通过不表达或低表达NKG2DL逃避NK细胞的杀伤。因此,有可能通过调节免疫激活物在LSCs的表达增强其被allo-NK杀伤的作用。LSCs存在多个信号通路异常,其中PI3K/AKT及NF-κB在导致LSCs凋亡抵抗及逃逸免疫治疗中起重要作用。手霉素(Manumycin,Manu)是链霉菌产生的天然抗生素,对多种肿瘤细胞有杀伤作用。我们前期的研究发现Manu能诱导NO产生,并通过线粒体凋亡途径诱导白血病细胞。手霉素可部分诱导LSCs凋亡,并能通过上调NKG2D配体恢复LSCs被allo-NK细胞杀伤的敏感性。但手霉素对LSCs的确切作用和机制尚不清楚。因此,本研究拟利用自建的LSC模型和分选自复发AML病人的LSCs,测定手霉素处理前后LSCs细胞活性,ROS生成及细胞凋亡情况,检测手霉素对LSCs表达NKG2DL及PI3K/AKT和NF-κB的影响,探讨ROS和PI3K/AKT/NF-κB在手霉素调控LSCs表达免疫激活物中的作用,旨在阐明手霉素调控LSCs表达免疫激活物的作用及其机制,为有效激活allo-NK细胞清除LSCs提供新靶点。方法第一章Manu提高LSCs被allo-NK细胞杀伤的敏感性1.从KGla细胞株分选CD34+CD38-LSCs及纯度检测;2.从健康人外周血分出单个核细胞,加入人IL-2、L-15诱导allo-NK细胞形成;***法检测Manu对allo-NK细胞杀伤KGla细胞株分选出LSCs的作用;第二章Manu诱导LSCs凋亡及ROS生成流式细胞术分别检测Manu对LSCs凋亡和ROS生成的影响。第三章Manu上调死亡受体DR5,下调PI3K/AKT/NF-KB在LSCs的表达***-blot法检测Manu干预后LSCs中外源性凋亡通路中关键蛋白DR5的表达情况。***-blot法检测Manu干预后LSCs中PI3K/AKT/NF-κB信号通路的关键蛋白 PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT,NF-κB 的表达情况。第四章Manu提高LSCs被allo-NK细胞杀伤需ROS的参与1.流式细胞术检测NAC对Manu诱导LSCs产生ROS的抑制作用。***-blot 法检测 NAC 对 Manu 调控 LSCs 表达 DR5、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT,NF-κB等蛋白的影响。3.流式细胞术检测NAC对LSCs细胞表达ULBP3和MICA/B的影响。***法检测NAC对Manu增强LSCs细胞被allo-NK细胞杀伤的影响。***法检测阻断LSCs表面NKG2DL与allo-NK表面NKG2D结合后allo-NK对LSCs杀伤的影响。结果第一章Manu提高LSCs被allo-NK细胞杀伤的敏感性1.从KGla细胞株分选LSCs及纯度检测从KGla细胞株分选出CD34+CD38-型LSCs;流式结果显示CD34+CD38-型LSCs占96%以上。2.成

关键词：手霉素白血病干细胞 allo-NK 细胞凋亡 PI3/AKT/NF-κB信号通路