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大鼠骨髓间充质干细胞体外培养与慢病毒转染方法的建立

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中国实验血液学杂志 2011年第6期19卷 1472-1476页

作者：张红珊方建培苏浩彬杨旻中山大学孙逸仙纪念医院儿科广东广州510120 复旦大学附属儿科医院消化科上海201102

本研究建立大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)体外分离培养、表型鉴定和标记的方法,为临床进行细胞移植治疗提供合格的细胞。无菌条件下取大鼠股骨、胫骨,用冲洗法冲出骨髓,贴壁培养法分离纯化BMMSC,体外扩增;流式细胞术进行免疫表型鉴定,并... 详细信息

本研究建立大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)体外分离培养、表型鉴定和标记的方法,为临床进行细胞移植治疗提供合格的细胞。无菌条件下取大鼠股骨、胫骨,用冲洗法冲出骨髓,贴壁培养法分离纯化BMMSC,体外扩增;流式细胞术进行免疫表型鉴定,并进行成骨,成脂分化鉴定;利用携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒液转染大鼠BMMSC。结果表明,贴壁培养法能有效分离纯化大鼠BMMSC,细胞呈均一的成纤维细胞样;流式细胞术显示,第4代BMMSC中CD29、CD44表达阳性,CD34、CD45表达阴性。在相应的诱导培养条件下,BMMSC均能成骨及成脂分化。BMMSC用慢病毒液转染后表达GFP。结论:贴壁培养法简单、可行和稳定;分离培养的细胞具有BMMSC的生物学特性和多向分化潜能;BMMSC经慢病毒液转染后表达GFP,标记效率高,可作为标记细胞的一种有效手段,适合体内示踪。

关键词：骨髓间充质干细胞慢病毒转染贴壁培养法

不同冻存液冻存慢病毒转染后稳转肝癌细胞株HepG2的效果比较

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重庆医学 2013年第28期42卷 3393-3394,3397页

作者：李佳陆会平冯振博莫伟嘉广西医科大学第一附属医院病理科南宁530021

目的筛选冻存慢病毒转染后稳转肝癌细胞株HepG2的最佳冻存液。方法采用甘油和二甲基亚砜(DMSO)2种不同冻存保护剂,以4种不同比例的冻存液分别冻存慢病毒转染后肝癌细胞HepG2及未转染的HepG2细胞,并对上述细胞复苏后的存活率及增殖能力... 详细信息

目的筛选冻存慢病毒转染后稳转肝癌细胞株HepG2的最佳冻存液。方法采用甘油和二甲基亚砜(DMSO)2种不同冻存保护剂,以4种不同比例的冻存液分别冻存慢病毒转染后肝癌细胞HepG2及未转染的HepG2细胞,并对上述细胞复苏后的存活率及增殖能力进行比较分析。结果采用甘油为冻存保护剂时,冻存液[DMEM∶胎牛血清(FBS)∶甘油]比例为0∶9∶1的转染后细胞存活率最高(P=0.001);未转染细胞存活率与冻存液比例无关(P=0.293)。采用DMSO为冻存保护剂时,转染后细胞存活率为0%;未转染细胞存活率在60%及以上,且与冻存液比例无关(P=0.487)。冻存液中血清含量越高,复苏后细胞的增殖能力越强(P慢病毒转染后的稳转肝癌细胞株HepG2的最佳冻存液为90%FBS+10%甘油。

关键词：慢病毒转染肝肿瘤细胞冻存

携带VEGF的慢病毒转染动物骨骼肌向海绵体结构转化的初步研究

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携带VEGF的慢病毒转染动物骨骼肌向海绵体结构转化的初步研究

作者：孙佳乐北京协和医学院

学位级别：硕士

目的:阴茎海绵体是明茎勃起功能的重要结构基础,各种先天性及获得性原因,均可导致阴茎的部分甚至全部病变、缺损,进而出现性功能障碍,探索重建阴茎海绵体的新方法对再造功能性阴茎具有重要意义。方法:前期工作中,采用自体组织股薄肌进... 详细信息

目的:阴茎海绵体是明茎勃起功能的重要结构基础,各种先天性及获得性原因,均可导致阴茎的部分甚至全部病变、缺损,进而出现性功能障碍,探索重建阴茎海绵体的新方法对再造功能性阴茎具有重要意义。方法:前期工作中,采用自体组织股薄肌进行阴茎再造,动物实验的结果证实了再造阴茎在电刺激下可较好的模拟勃起。在此基础上,进一步通过人VEGF165过表达的慢病毒基因载体(LV-GFP-HuVEGF165)转染实验动物犬再造阴茎的肌肉组织,通过神经电刺激对再造阴茎的长度、直径、硬度进行测量,与转染前实验数据进行对比,并观察组织形态学染色;LV-GFP-HuVEGF165转染大鼠腓肠肌,促使骨骼肌内细胞向平滑肌转变,同时进行诱导血管再生,通过免疫组化测定a-SMA,eNOS表达,探索骨骼肌向海绵体组织转化的可能。结果:经过LV-GFP-HuVEGF165转染的实验动物犬的再造阴茎的尺寸、硬度及对于神经刺激的反应与转染前无显著区别,且未造成肌肉组织坏死等不良影响;实验动物SD大鼠经过LV-GFP-HuVEGF165转染的骨骼肌,组织学显示骨骼肌内a-SMA表达阳性,出现类似平滑肌组织的结构,eNOS表达阳性,实验组血管密度明显高于阴性对照组及空白对照组。结论:转染病毒等犬股薄肌生理功能及形态不受影响;转染病毒的SD大鼠腓肠肌可诱导产生平滑肌组织和新生血管形成。

关键词：阴茎海绵体慢病毒转染平滑肌细胞血管内皮细胞

HLA-G慢病毒转染抑制NK细胞毒功能的实验研究

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中国急救复苏与灾害医学杂志 2018年第8期13卷 749-752页

作者：张晓莉赵春艳陈黎中国人民武装警察部队总医院北京100039 中国人民解放军总医院

目的建立-株稳定表达人类白细胞抗原G（human leucocyte antigenG，HLA—G）的子宫内膜癌细胞系，探讨HLA—G对NK92细胞的杀伤活性影响。方法将HLA—G慢病毒包装并转染于HEC-1-B细胞系，稳定转染HLA—G基因的I-IEC-1-B与NK92细胞系共培... 详细信息

目的建立-株稳定表达人类白细胞抗原G（human leucocyte antigenG，HLA—G）的子宫内膜癌细胞系，探讨HLA—G对NK92细胞的杀伤活性影响。方法将HLA—G慢病毒包装并转染于HEC-1-B细胞系，稳定转染HLA—G基因的I-IEC-1-B与NK92细胞系共培养，并使用乳酸脱氢酶（1actate dehydrognase，LDH）释放法检测HLA—G表达对自然杀伤（naturalkiller，NK）92细胞杀伤活性的影响。结果外源基因HLA—G成功介导转染在人子宫内膜癌HEC-1-B细胞系，通过免疫荧光可见HLA—G表达率为95％，乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测HLA—G基因表达能够有效抑制NK92细胞的杀伤活性，与对照组相比有统计学意义（P〈0．05）。结论HLA—G是-个重要的免疫抑制分子，稳定表达HLA—G的子宫内膜癌细胞可明显抑制NK92细胞的杀伤活性，可能诱导移植免疫耐受的发生。

关键词： HLA-G 慢病毒转染 NK细胞毒

重组慢病毒介导超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4基因转染BMSCs的实验研究

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中国修复重建外科杂志 2013年第12期27卷 1512-1516页

作者：于风旭方易冰刘炫赖前成贾建博廖斌泸州医学院附属医院心胸外科四川泸州646000

目的探讨重组慢病毒（1entivirus，LVs）介导超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4（hyperpo。***4，HCN4）基因转染大鼠BMSCs构建生物起搏细胞的可行性。方法选取3～5周龄SD大鼠，采用改良全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs。以LVs作为转... 详细信息

目的探讨重组慢病毒（1entivirus，LVs）介导超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4（hyperpo。***4，HCN4）基因转染大鼠BMSCs构建生物起搏细胞的可行性。方法选取3～5周龄SD大鼠，采用改良全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs。以LVs作为转染载体，增强绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP）为标记，构建***病毒液。取第3代BMSCs分别转染LVs—***病毒液（实验组）和***空白病毒液（对照组），荧光显微镜观察转染24、48、72h后两组绿色荧光表达情况，72h时Westernblot检测HCN4蛋白表达；电生理检测实验组转染72h后BMSCs的起搏电流。结果实验组BMSCs形态正常、生长良好；48h后荧光显微镜下可见散在的绿色荧光，转染效率约10％；72h荧光表达稍增多，转染效率为20％～25％。对照组未见绿色荧光表达。Westernblot检测示转染72h后，实验组可见与HCN4蛋白相对分子质量相同的条带表达，而对照组仅有微弱表达；实验组蛋白条带灰度值为33．75±0．41，显著高于对照组的23．39±0．33（t=17．524，P=-0．013）。实验组转染后的BMSCs检测到起搏电流，并能被CsCl完全阻断，符合起搏电流特点。结论重组LVs介导HCN4基因成功转染大鼠BMSCs，并检测到HCN4蛋白表达及起搏电流。

关键词：超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4 BMSCs 慢病毒转染起搏电流

慢病毒介导NGF过表达转染促进骨髓间充质干细胞向神经细胞转化的研究

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中国临床研究 2019年第2期32卷 145-149页

作者：邓明谢萍马永刚明江华周炎陈庆刘志勇刘世清武汉大学人民医院骨科湖北武汉430060 武汉市第三医院中医科湖北武汉430060 武汉大学人民医院风湿免疫科湖北武汉430060

目的探究慢病毒介导神经生长因子(NGF)过表达转染促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞转化的作用。方法体外分离,培养人BMSCs,利用基因过表达技术,构建NGF过表达慢病毒载体转染BMSCs。根据转染情况分成3组,空白对照组(未转染慢病毒... 详细信息

目的探究慢病毒介导神经生长因子(NGF)过表达转染促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞转化的作用。方法体外分离,培养人BMSCs,利用基因过表达技术,构建NGF过表达慢病毒载体转染BMSCs。根据转染情况分成3组,空白对照组(未转染慢病毒载体的BMSCs)、空白载体病毒组(转染不含NGF过表达慢病毒载体的BMSCs)和过表达载体病毒组(转染过表达NGF慢病毒载体的BMSCs)。利用流式细胞仪检测BMSCs的表面标记物,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot分别检测神经细胞表面蛋白胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE) mRNA及蛋白的表达。结果 (1) BMSCs的表面蛋白标记物CD44和CD29在第2代BMSCs的表达为60. 2%和58. 3%,CD34和CD45在第2代BMSCs的表达为3. 4%和2. 6%。(2)慢病毒转染效率为90%以上。转染效率较高。(3)空白对照组、空白载体病毒组和过表达载体病毒组的GFAP和NSE mRNA的相对表达量三组比较有统计学差异(P 病毒组和空白对照组的组间比较无统计学差异(P> 0. 05);过表达载体病毒组高于空白载体病毒组,组间比较有统计学差异(P 慢病毒介导NGF过表达转染促进BMSCs可以提高BMSCs向神经细胞转化的效率,可以为神经损伤和脊髓损伤提供种子细胞。

关键词：神经生长因子骨髓间充质干细胞慢病毒转染胶质纤维酸性蛋白神经元特异性烯醇化酶

慢病毒载体介导Shh基因转染雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究

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慢病毒载体介导Shh基因转染雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究

作者：唐浩帅天津医科大学

学位级别：硕士

【目的】脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）后的神经功能恢复一直是困扰医学界的难题,其中轴突的再生和髓鞘化是突破这一难题的重要修复方式,本研究通过慢病毒介导音猥因子（Sonic Hedgehog,Shh）转染大鼠雪旺细胞,持续稳定分泌Shh因... 详细信息

【目的】脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）后的神经功能恢复一直是困扰医学界的难题,其中轴突的再生和髓鞘化是突破这一难题的重要修复方式,本研究通过慢病毒介导音猥因子（Sonic Hedgehog,Shh）转染大鼠雪旺细胞,持续稳定分泌Shh因子,同时促进雪旺细胞的增殖活性以及分泌神经营养因子功能,移植稳定表达Shh因子的雪旺细胞于脊髓损伤部位,探讨Shh因子联合雪旺细胞在修复脊髓损伤中的作用及其发挥协同作用的相关机制,为细胞移植联合基因修饰促进SCI修复提供新策略。【方法】1.大鼠雪旺细胞的分离、培养和鉴定:本研究选取出生后3-5天的SD（Sprague Dawley）大鼠,在其坐骨神经中分离雪旺细胞（Schwann Cells,SCs）,通过双酶消化和差速贴壁对雪旺细胞进行分离、培养以及纯化,S-100免疫荧光对雪旺细胞进行鉴定。2.慢病毒转染雪旺细胞及筛选:构建p LVX-IRES-Puro-Shh慢病毒表达载体,将纯化后的雪旺细胞传代至6孔板中加入病毒工作液,转染成功后加入嘌呤霉素筛选出稳定表达Shh因子的雪旺细胞（S-SCs）。3.检测细胞活性及表达因子:利用MTT法进行细胞活性测定,绘制细胞生长曲线;多时间点ELISA法检测Shh因子及BDNF、NGF的表达水平的变化。4.动物模型的建立及移植后行为学评价:雌性SD大鼠（240±10g）,8周龄,采用Impactor Model II打击系统,建立脊髓挫伤模型,大鼠SCI后7天,在损伤部位进行移植。行为学评价包括SCI后当天以及SCI后12周内每隔2周对各组大鼠进行BBB评分,评估各组大鼠后肢功能的恢复情况。5.移植后损伤区域神经细胞改变:SCI后第12周,通过NF200标记轴突,损伤中心横切染色,观察脊髓损伤局部轴突改变情况;SCI后第2、12周,通过Nestin标记神经干细胞、Olig2标记少突胶质细胞前体细胞、GFAP标记星形胶质细胞,损伤中心横切染色,观察神经细胞的增殖和分化情况。6.移植后损伤区域白质和髓鞘改变:SCI后第2、12周,各组大鼠以损伤部位为中心进行横切,行甲苯胺蓝染色,高倍镜下观察损伤局部的白质和髓鞘改变。【结果】1.细胞形态与生长情况观察:经筛选后转染Shh因子的雪旺细胞符合典型雪旺细胞特征,S-100染色观察转染Shh因子雪旺细胞与正常细胞形态一致。纯化培养后光镜下观察各组雪旺细胞生长情况,S-SCs组细胞密度高于SCs组与V-SCs组,慢病毒转染后未对细胞生长产生负担。2.细胞增殖活性及表达因子检测:通过MTT法检测发现细胞增殖曲线为指数型,S-SCs组细胞增殖活性高于V-SCs组和SCs组,无负代谢影响,其差异具有统计学意义（P＜0.05）;通过ELISA法进行不同时间点Shh、BDNF和NGF含量检测,S-SCs组明显高于SCs组和V-SCs组,可持续稳定分泌至第8周。3运动功能评价:脊髓损伤后12周内对动物进行BBB评分,各组大鼠后肢功能均有恢复,在损伤后第12周,与DMEM移植组和SCs移植组相比,S-SCs移植组BBB评分最高,其差异具有统计学意义（P＜0.01）,S-SCs移植组更好的促进了大鼠后肢的运动功能恢复。4.移植后损伤区域神经细胞改变:免疫荧光染色结果显示,与SCs移植组组和DMEM移植组相比,S-SCs移植组的损伤中心NF200阳性细胞数最多（P＜0.01）;在损伤后第2周和12周,免疫荧光染色结果显示损伤中心Nestin阳性细胞、损伤中心及周围白质的Olig2阳性细胞数,S-SCs移植组最多,SCs移植组和DMEM移植组较少（P＜0.01）;损伤后第2周,损伤区域GFAP阳性细胞数DMEM移植组多于SCs移植组和S-SCs移植组（P＜0.05）,至第12周S-SCs移植组GFAP阳性细胞数最少,其差异具有统计学意义（P＜0.01）。5.移植后损伤局部白质和髓鞘的改变:在SCI第2周时,各组SCI中心白质区损伤严重;第12周时,DMEM组白质区域神经纤维结构不清,排列紊乱;而S-SCs组白质区域神经纤维结构清晰,可见囊性结构中有髓鞘出现,与DMEM组相比可明显改善SCI后损伤面积,减少慢性期的空洞形成。【结论】1.雪旺细胞通过慢病毒转染Shh基因后,能够持续、稳定表达Shh因子,提高雪旺细胞的增殖活性以及神经营养因子BDNF、NGF的表达水平,并且其效果具有长期稳定的特征。2.脊髓损伤局部移植持续稳定表达Shh因子的雪旺细胞,较单纯移植SCs或DMEM,可显著减少损伤区域胶质瘢痕形成,促进损伤区域轴突再生和髓鞘化,促进大鼠后肢功能恢复。***因子能够增强雪旺细胞的自身活性,并维持稳定表达,通过基因修饰手段将雪旺细胞与Shh因子联合,优势互补,产生协同作用,在损伤后激活内源性神经细胞,促进神经

关键词：脊髓损伤音猥因子慢病毒转染雪旺细胞神经营养因子细胞移植

成熟T淋巴细胞分离培养及其慢病毒介导的基因转染的研究

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成熟T淋巴细胞分离培养及其慢病毒介导的基因转染的研究

作者：叶丽伟第二军医大学

学位级别：硕士

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSc)是利用病毒载体将特定转录因子组合转入分化细胞,使其重编程为类似胚胎干细胞的一类细胞。它不仅具有自我更新和多向分化潜能,而且在细胞形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态... 详细信息

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSc)是利用病毒载体将特定转录因子组合转入分化细胞,使其重编程为类似胚胎干细胞的一类细胞。它不仅具有自我更新和多向分化潜能,而且在细胞形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、类胚体和畸形瘤生成能力等方面都与胚胎干细胞相似。该技术是2006年由Yamanaka将重组有Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4四个转录因子基因的病毒载体引入小鼠成纤维细胞,并成功诱导其重编程而最先创建的。在随后的研究中,如何选用来源便捷、数目充足的成熟体细胞为重编程的靶细胞,成为iPS研究的热点之一。而具备上述选材条件的成熟T淋巴细胞,却存在体外成活时间短和病毒转导效率极低等技术难题。慢病毒(lentivirus)载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒(HIV-1)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。在相关的细胞实验操作中,对于一些按常规方法难以转入甚至无法转入的细胞,如原代细胞、干细胞等未分化细胞,通过慢病毒介导的方法能够大大提高基因的转导效率,而且使目的基因整合到宿主细胞基因组的几率也明显增加,这为报告基因在细胞内的高效瞬时表达研究提供了有利途径。本研究建立了适合小鼠成熟活化T淋巴细胞体外长时间培养,以及慢病毒转导的技术平台,获得的主要研究结果如下: 1、成熟T淋巴细胞的增殖与活化。采用Ficoll梯度离心法分离小鼠单个核细胞,分别用刀豆蛋白A(ConA)和anti-mouse CD3 & anti-mouse CD28等方法活化成熟T淋巴细胞,并利用流式细胞法检测T细胞表面CD4CD44等活化标志;羧基荧光素双乙酸盐-琥珀酰亚胺酯(CFSE)示踪法检测活化细胞的增殖分裂状况。结果显示:可从3月龄的雌性Balb/c小鼠(SPF级)的脾脏中分离到～2×10单个核细胞;96孔“U”型板经anti-mouse CD3 & anti-mouse CD28(终浓度分别为2μg/mL、4μg/mL)包被后,可使2.0×10个细胞/孔在第三天(D3)迅速增殖至1.6×10个细胞/孔,经过anti-mouse CD3 & anti-mouse CD28刺激活化的CD4+CD44high T淋巴细胞占活细胞总数的(74.0±1.8)%,且CFSE强阳性细胞由原来(92.3±2.8)%降至(16.34±1.3)%;该活化T淋巴细胞在含IL-2(终浓度30 ng/mL)CTL培养基中可维持生长(D14细胞数为1.5×10/孔);而经ConA刺激激活的T淋巴细胞在D7才能达到最高值1.4×10个细胞/孔,且随着培养时间延长,细胞凋亡增多,直至完全死亡。实验评价了小鼠成熟T淋巴细胞在体外培养条件下能否保持长期的增殖与活化状况的可行性,为下一步进行GFP重组慢病毒转导奠定基础。 2、慢病毒的包装及对成熟T淋巴细胞的转染效率。采用脂质体将GFP重组慢病毒质粒转染到包装细胞293T中,48小时后收集细胞上清液,进一步用超速离心的方法纯化GFP重组慢病毒,转导LEPC细胞D2后,采用流式细胞法检测其转染效率和病毒滴度。最后将纯化的GFP重组慢病毒分别按MOI=1,5,10等不同滴度,转染经anti-mouse CD3 & anti-mouse CD28刺激激活的T淋巴细胞,并观测GFP重组慢病毒对T淋巴细胞的转染效率。结果显示:经脂质体法将GFP重组慢病毒质粒转染到包装细胞293T,在48小时后,293T全部带有绿色荧光,转染效率为95%以上。未纯化的GFP重组慢病毒颗粒(500μL病毒/孔)转导LEPC细胞,经流式细胞仪分析GFP的阳性率为(85.9±3.6)%;而经超离纯化浓缩10倍的重组慢病毒组(50μL病毒/孔),其GFP阳性率仍达(74.3±1.8)%。纯化后的GFP重组慢病毒转染经anti-mouse CD3 & anti-mouse CD28刺激激活的T淋巴细胞3天后,GFP阳性率分别为:MOI=1组(25.8±1.75)%,MOI=5组(36.0±9.5)%,MOI=10组(43.0±4.75)%;与同滴度的腺病毒相比,其转染T淋巴细胞的效率有较明显地提高;且随着GFP重组慢病毒滴度的增加,对T淋巴细胞的转染效率也愈高。有关进一步提高慢病毒对该T淋巴细胞转导效率的实验目前仍在进行中。该技术体系的建立与不断完善,为下一步用肝特异性转录因子诱导成熟T淋巴细胞分化为肝干细胞准备了条件。

关键词：诱导多能干细胞慢病毒转染 T淋巴细胞流式细胞法

miRNA-378a过表达巨噬细胞株复合胶原蛋白海绵:抗炎及促进组织修复

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中国组织工程研究 2025年第4期29卷 789-799页

作者：王思凡何惠宇杨泉韩祥祯新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)口腔修复种植科新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830054 新疆维吾尔自治区口腔医学研究所新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830054 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市口腔医院新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830000

背景:巨噬细胞M1/M2极化方向的调节在组织工程应用中尤为关键,及时调控可最大程度地减少促炎、促进抗炎或组织愈合反应。目的:将慢病毒介导的miRNA-378a过表达巨噬细胞株复合胶原蛋白海绵回植入动物模型,据此检测免疫调节在体内环境中... 详细信息

背景:巨噬细胞M1/M2极化方向的调节在组织工程应用中尤为关键,及时调控可最大程度地减少促炎、促进抗炎或组织愈合反应。目的:将慢病毒介导的miRNA-378a过表达巨噬细胞株复合胶原蛋白海绵回植入动物模型,据此检测免疫调节在体内环境中的相关表达水平等组织修复相关的指标,进一步阐明在体内环境中miRNA-378a是否促进巨噬细胞M2极化及其对免疫调节和组织修复的作用。方法:将慢病毒介导的miRNA-378a过表达巨噬细胞株、阴性对照病毒巨噬细胞株扩增、筛选,复苏培养巨噬细胞株后与胶原蛋白海绵共培养以此构成复合体,具体分组如下:①阳性组:过表达miRNA-378a巨噬细胞-胶原蛋白海绵复合体;②阴性组:阴性对照病毒介导的miRNA-378a巨噬细胞-胶原蛋白海绵复合体;③对照组:巨噬细胞-胶原蛋白海绵;④空白对照组:胶原蛋白海绵。通过免疫荧光及扫描电镜观察各组细胞密度、表型、黏附情况,后回植入小鼠背部皮下模型,分别于造模后4,7 d处死小鼠,通过大体观察、苏木精-伊红染色、Masson染色、免疫组化分析慢病毒介导的miRNA-378a过表达巨噬细胞胶原蛋白海绵复合体中巨噬细胞极化的方向及其对机体免疫调控、组织修复的作用。结果与结论:①免疫荧光镜下观察各组巨噬细胞株确实与胶原蛋白海绵形成复合体;②扫描电镜下慢病毒介导的miRNA-378a巨噬细胞(阳性组)较其他分组细胞密度增加,细胞出现球形、椭圆形及多边形分化,具有更多的伪足;③大体观察下总体7 d愈合好于4 d,慢病毒介导的miRNA-378a过表达巨噬细胞(阳性组)无论4,7 d愈合均好于其他分组;④苏木精-伊红染色、Masson染色下,慢病毒介导的miRNA-378a过表达巨噬细胞(阳性组)具有较多量的纤维细胞、毛细血管、成纤维细胞以及胶原纤维增生;⑤免疫组化显示,慢病毒介导的miRNA-378a过表达巨噬细胞(阳性组)无论4,7 d M2极化细胞阳性率均大于其他分组;对照组及阴性组巨噬细胞无论4,7 d M2极化细胞阳性率均大于空白对照组,而对照组及阴性组之间无统计学差异;阳性组、阴性组、对照组无论4,7 d染色细胞数量均大于空白对照组,且阳性组>阴性组≈对照组>空白对照组;⑥提示在体内环境中miRNA-378a过表达巨噬细胞具有较多量的纤维细胞、毛细血管、成纤维细胞以及胶原纤维增生,对组织修复起到了正向作用,并且能促进巨噬细胞向M2型极化并抑制M1型极化,从而有助于减少机体炎症反应。

关键词： miRNA-378a 慢病毒转染巨噬细胞极化免疫调节组织工程