慢病毒载体介导Shh基因转染雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究

作     者：唐浩帅 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：冯世庆

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：脊髓损伤 音猥因子 慢病毒转染 雪旺细胞 神经营养因子 细胞移植 

摘      要：【目的】脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）后的神经功能恢复一直是困扰医学界的难题,其中轴突的再生和髓鞘化是突破这一难题的重要修复方式,本研究通过慢病毒介导音猥因子（Sonic Hedgehog,Shh）转染大鼠雪旺细胞,持续稳定分泌Shh因子,同时促进雪旺细胞的增殖活性以及分泌神经营养因子功能,移植稳定表达Shh因子的雪旺细胞于脊髓损伤部位,探讨Shh因子联合雪旺细胞在修复脊髓损伤中的作用及其发挥协同作用的相关机制,为细胞移植联合基因修饰促进SCI修复提供新策略。【方法】1.大鼠雪旺细胞的分离、培养和鉴定:本研究选取出生后3-5天的SD（Sprague Dawley）大鼠,在其坐骨神经中分离雪旺细胞（Schwann Cells,SCs）,通过双酶消化和差速贴壁对雪旺细胞进行分离、培养以及纯化,S-100免疫荧光对雪旺细胞进行鉴定。2.慢病毒转染雪旺细胞及筛选:构建p LVX-IRES-Puro-Shh慢病毒表达载体,将纯化后的雪旺细胞传代至6孔板中加入病毒工作液,转染成功后加入嘌呤霉素筛选出稳定表达Shh因子的雪旺细胞（S-SCs）。3.检测细胞活性及表达因子:利用MTT法进行细胞活性测定,绘制细胞生长曲线;多时间点ELISA法检测Shh因子及BDNF、NGF的表达水平的变化。4.动物模型的建立及移植后行为学评价:雌性SD大鼠（240±10g）,8周龄,采用Impactor Model II打击系统,建立脊髓挫伤模型,大鼠SCI后7天,在损伤部位进行移植。行为学评价包括SCI后当天以及SCI后12周内每隔2周对各组大鼠进行BBB评分,评估各组大鼠后肢功能的恢复情况。5.移植后损伤区域神经细胞改变:SCI后第12周,通过NF200标记轴突,损伤中心横切染色,观察脊髓损伤局部轴突改变情况;SCI后第2、12周,通过Nestin标记神经干细胞、Olig2标记少突胶质细胞前体细胞、GFAP标记星形胶质细胞,损伤中心横切染色,观察神经细胞的增殖和分化情况。6.移植后损伤区域白质和髓鞘改变:SCI后第2、12周,各组大鼠以损伤部位为中心进行横切,行甲苯胺蓝染色,高倍镜下观察损伤局部的白质和髓鞘改变。【结果】1.细胞形态与生长情况观察:经筛选后转染Shh因子的雪旺细胞符合典型雪旺细胞特征,S-100染色观察转染Shh因子雪旺细胞与正常细胞形态一致。纯化培养后光镜下观察各组雪旺细胞生长情况,S-SCs组细胞密度高于SCs组与V-SCs组,慢病毒转染后未对细胞生长产生负担。2.细胞增殖活性及表达因子检测:通过MTT法检测发现细胞增殖曲线为指数型,S-SCs组细胞增殖活性高于V-SCs组和SCs组,无负代谢影响,其差异具有统计学意义（P0.05）;通过ELISA法进行不同时间点Shh、BDNF和NGF含量检测,S-SCs组明显高于SCs组和V-SCs组,可持续稳定分泌至第8周。3运动功能评价:脊髓损伤后12周内对动物进行BBB评分,各组大鼠后肢功能均有恢复,在损伤后第12周,与DMEM移植组和SCs移植组相比,S-SCs移植组BBB评分最高,其差异具有统计学意义（P0.01）,S-SCs移植组更好的促进了大鼠后肢的运动功能恢复。4.移植后损伤区域神经细胞改变:免疫荧光染色结果显示,与SCs移植组组和DMEM移植组相比,S-SCs移植组的损伤中心NF200阳性细胞数最多（P0.01）;在损伤后第2周和12周,免疫荧光染色结果显示损伤中心Nestin阳性细胞、损伤中心及周围白质的Olig2阳性细胞数,S-SCs移植组最多,SCs移植组和DMEM移植组较少（P0.01）;损伤后第2周,损伤区域GFAP阳性细胞数DMEM移植组多于SCs移植组和S-SCs移植组（P0.05）,至第12周S-SCs移植组GFAP阳性细胞数最少,其差异具有统计学意义（P0.01）。5.移植后损伤局部白质和髓鞘的改变:在SCI第2周时,各组SCI中心白质区损伤严重;第12周时,DMEM组白质区域神经纤维结构不清,排列紊乱;而S-SCs组白质区域神经纤维结构清晰,可见囊性结构中有髓鞘出现,与DMEM组相比可明显改善SCI后损伤面积,减少慢性期的空洞形成。【结论】1.雪旺细胞通过慢病毒转染Shh基因后,能够持续、稳定表达Shh因子,提高雪旺细胞的增殖活性以及神经营养因子BDNF、NGF的表达水平,并且其效果具有长期稳定的特征。2.脊髓损伤局部移植持续稳定表达Shh因子的雪旺细胞,较单纯移植SCs或DMEM,可显著减少损伤区域胶质瘢痕形成,促进损伤区域轴突再生和髓鞘化,促进大鼠后肢功能恢复。***因子能够增强雪旺细胞的自身活性,并维持稳定表达,通过基因修饰手段将雪旺细胞与Shh因子联合,优势互补,产生协同作用,在损伤后激活内源性神经细胞,促进神经