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大鼠RNAi-A2aR慢病毒载体的构建及鉴定

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中华麻醉学杂志 2020年第7期40卷 800-804页

作者：夏韵 Mohamed Bassirou MY 周慧敏李婧凡陈超柯剑娟王焱林武汉大学中南医院麻醉科 430071 贵州医科大学附属医院麻醉科贵阳550004

目的构建大鼠RNAi-腺苷A2a受体(A2aR)慢病毒载体并进行鉴定。方法首先构建3对短发夹RNA(shRNA)-A2aR序列(shRNA-A2aR 1、shRNA-A2aR 2、shRNA-A2aR 3),在shRNA慢病毒载体中分别插入3对双链shRNA oligo,shRNA慢病毒重组质粒构建成功后,将重组质粒、包装载体、穿梭载体共转染293T细胞,从而获得病毒液。实验Ⅰ采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为3组(n=6):空载组(V组)、shRNA-A2aR 1组和shRNA-A2aR 3组,各组分别转染MOI为10的相应病毒液,转染48 h时,Western blot法检测A2aR表达水平,确定干扰效率,以筛选最佳慢病毒载体。实验Ⅱ采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为5组(n=36):空载组(V组)、MOI5组、MOI10组、MOI15组和MOI20组,各组分别转染相应MOI的病毒液(最佳慢病毒载体),于转染24、48和72 h时,采用CCK-8法测定细胞存活率,荧光显微镜下观察细胞活力和细胞死亡情况,Western blot法检测A2aR表达水平,确定干扰效率。结果实验Ⅰ成功构建了2种shRNA-A2aR慢病毒载体(shRNA-A2aR 1、3)。shRNA-A2aR 3病毒液滴度为3.5×10^8 TU/ml。与V组和shRNA-A2aR 1组比较,shRNA-A2aR 3组心肌细胞A2aR表达下调(P慢病毒载体干扰效率73%。实验Ⅱ选择shRNA-A2aR 3慢病毒载体转染24 h时,各组细胞存活率均>85%;转染48 h时,MOI5组和MOI10组细胞存活率>80%;转染72 h各组细胞存活率70%。结论成功构建了大鼠shRNA-A2aR慢病毒载体,且MOI为10、转染48 h或MOI为20、转染24 h为最佳转染方案。

关键词：受体,腺苷A2A RNA干扰慢病毒属心肌细胞

慢病毒介导miRNA-184体外转染对人晶状体上皮细胞上皮间质转分化的影响

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中华眼科杂志 2015年第4期51卷 295-300页

作者：徐庆李贞张慧上海建工医院眼科 200083

目的观察慢病毒介导miRNA-184体外转染对TGF-β2诱导人LEC发生上皮间质转分化（EMT）时其基因表型的影响.方法实验研究.构建pL/IRES/GFP-miR-184质粒,经慢病毒介导体外转染由TGF-β2诱导而发生EMT的人LEC,利用QRT-PCR检测转染0、6、2... 详细信息

目的观察慢病毒介导miRNA-184体外转染对TGF-β2诱导人LEC发生上皮间质转分化（EMT）时其基因表型的影响.方法实验研究.构建pL/IRES/GFP-miR-184质粒,经慢病毒介导体外转染由TGF-β2诱导而发生EMT的人LEC,利用QRT-PCR检测转染0、6、24 h后人LEC中相关基因E-钙黏蛋白（CDH1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（VIM）表达水平的变化,并与阴性对照慢病毒侵染组进行比较.采用单因素方差分析进行统计学分析.结果成功构建pL/IRES/GFP-miR-184质粒,经慢病毒介导转染由TGF-β2诱导而发生EMT的人LEC 24 h后,上皮细胞标志性基因CDH1相对表达量保持相对不变,24 h时为6.30E-06,而对照组则下调,24 h时为1.37E-06,差异有统计学意义（F=261.78,P＜0.01）;间质细胞标志性基因α-SMA和VIM的相对表达量均保持相对不变,24 h时分别为1.55E-02和4.61E-04,而对照组则均上调,24 h时分别为2.09E-02和6.73E-04,差异有统计学意义（F=26.21,P=0.007;F=17.91,P=0.013）.结论 miRNA-184经慢病毒介导转染人LEC后,能抑制其由TGF-β2诱导所发生的EMT相关的基因表型变化。

关键词：晶体上皮细胞上皮-间质转化转染慢病毒属

整合素连接激酶基因敲降和黑色素瘤分化相关基因过表达慢病毒载体构建和鉴定

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浙江大学学报（医学版） 2014年第2期43卷 193-199页

作者：杨幼萍丁燕王继荣曾玲晖林红霞朱杨丽吴宏卫王若燕张建民应荣彪浙江省台州市肿瘤医院浙江温岭310075 台州市中心医院浙江台州318000 浙江大学城市学院医学院浙江杭州310015

目的：建立整合素相关激酶（ ILK）基因敲降和黑色素瘤分化相关基因（ mda7）过表达慢病毒包装表达系统。方法：针对人ILK基因序列，设计基因敲降靶点序列（A、B、C），通过限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接，将ILK插... 详细信息

目的：建立整合素相关激酶（ ILK）基因敲降和黑色素瘤分化相关基因（ mda7）过表达慢病毒包装表达系统。方法：针对人ILK基因序列，设计基因敲降靶点序列（A、B、C），通过限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接，将ILK插入慢病毒载体pSicoR-eGFP，构建siILK-pSicoR-eGFP重组质粒；根据人mda7基因序列，设计引物扩增mda7全长，并插入慢病毒载体pLVX-Puro，构建mda7-pLVX-Puro重组质粒。经双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染人胚肾细胞系293 T细胞，进行慢病毒包装并测定病毒滴度、观察感染效率。各组病毒载体转染PC-3细胞后，用定量PCR和蛋白质印迹法检测ILK基因和mda7 mRNA转录水平及蛋白表达水平。通过MTT法和Transwell实验考察ILK和mda7对PC-3细胞增殖和迁移的影响。结果：成功构建ILK基因敲降及mda7过表达的慢病毒载体，四质粒系统共转染293 T细胞后可见大量绿色荧光染色阳性细胞。浓缩病毒后293 T细胞的感染效率在90％以上，并能高效率感染PC-3前列腺癌细胞。 ILK-A-pSicoR-eGFP和ILK-B-pSicoR-eGFP组ILK干扰效果最佳（P＜0．05），mda7的表达水平远高于对照组（P＜0．05），且持续稳定表达至少1个月。 ILK和mda7对PC-3细胞的增殖在96 h内有明显抑制作用，并对其迁移亦有显著抑制（均P＜0．05）。结论：成功构建并鉴定人ILK 基因敲降和mda7过表达慢病毒载体，可为探讨ILK和mda7基因在肿瘤细胞中的生物学功能提供良好工具，也为探索安全、高效的肿瘤治疗途径奠定实验基础。

关键词：整合素类磷酸转移酶类前列腺肿瘤白细胞介素类基因,肿瘤抑制慢病毒属遗传学遗传载体基因表达

慢病毒介导的类表皮生长因子域7基因沉默抑制喉癌Hep-2细胞增殖和侵袭的研究

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中华耳鼻咽喉头颈外科杂志 2014年第8期49卷 643-648页

作者：黎景佳叶进庄士民王涛王志远常利红张革化中山大学附属第三医院耳鼻咽喉头颈外科广州510630

目的探讨小干扰RNA（siRNA）重组慢病毒介导的类表皮生长因子域7（epidermal growth factor-like domain 7,EGFL7）基因沉默对体外培养喉癌Hep-2细胞增殖和侵袭潜能的影响.方法采用RNA干扰技术,构建靶向EGFL7的shRNA重组慢病毒并转染H... 详细信息

目的探讨小干扰RNA（siRNA）重组慢病毒介导的类表皮生长因子域7（epidermal growth factor-like domain 7,EGFL7）基因沉默对体外培养喉癌Hep-2细胞增殖和侵袭潜能的影响.方法采用RNA干扰技术,构建靶向EGFL7的shRNA重组慢病毒并转染Hep-2细胞,通过Real-timePCR和Western blot在mRNA及蛋白水平鉴定转染结果;实验分为空白对照组（NC）、空白慢病毒感染组（Lenti-NC）和EGFL7基因沉默慢病毒感染组（Lenti-EGFL7）,采用CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,Transwell侵袭实验观察细胞侵袭能力.结果 Real-time PCR检测说明Lenti-EGFL7组mRNA相对表达量较NC组下降达94％（P＜0.001）,Western blot检测证实Lenti-EGFL7组EGFL7蛋白相对表达量为（0.07 ±0.04）较NC组的（0.39 ±0.12）明显减低（P ＜0.001）,表明成功构建稳定沉默EGFL7基因的喉癌Hep-2细胞株.CCK-8细胞增殖实验说明靶向沉默EGFL7表达导致喉癌细胞增殖明显抑制（P＜0.01）,流式细胞术检测证实,与NC组和Lenti-NC组相比,Lenti-EGFL7组S期细胞百分比明显升高（P＜0.01）,G1期细胞百分比下降（P＜0.05）,细胞凋亡检测证实Lenti-EGFL7组细胞凋亡率为（66.2±1.28）％较NC组的（6.09±3.28）％和Lenti-NC组的（9.86±2.13）％明显增加（P ＜0.001）.Transwell侵袭实验发现Lenti-EGFL7组穿过Matrigel到达下室的平均细胞数较NC组和Lenti-NC组均明显减少（P＜0.01）.结论靶向沉默EGFL7基因能抑制体外培养喉癌Hep-2细胞的增殖并降低细胞侵袭能力.

关键词： RNA,小分子干扰喉肿瘤表皮生长因子细胞增殖肿瘤侵润慢病毒属肿瘤细胞,培养的

慢病毒介导人骨形态发生蛋白2/骨髓间充质干细胞/脱钙骨基质修复股骨大段缺损

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中国组织工程研究 2018年第9期22卷 1338-1343页

作者：陶旋李强李诗鹏石正松周桢杰桂林医学院附属医院急诊创伤外科广西壮族自治区桂林市541001

背景:课题组前期研究已证实,慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2基因转染兔骨髓间充质干细胞在表达持续时间上具有一定的优势。但慢病毒介导人骨形态发生蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞复合脱钙骨基质能否在体内促进骨缺损修复的问题... 详细信息

背景:课题组前期研究已证实,慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2基因转染兔骨髓间充质干细胞在表达持续时间上具有一定的优势。但慢病毒介导人骨形态发生蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞复合脱钙骨基质能否在体内促进骨缺损修复的问题有待探究。目的:观察兔股骨大段缺损中植入慢病毒介导人骨形态发生蛋白2转染骨髓间充质干细胞复合脱钙骨基质后的修复效果,探寻治疗股骨大段缺损的新途径。方法:选取48只新西兰大白兔,股骨中段截骨钢板内固定法制备兔左侧股骨大段缺损模型。造模成功后,随机分成A,B,C,D组,每组12只。A组无修复材料植入,B,C,D组分别植入脱钙骨基质、脱钙骨基质/骨髓间充质干细胞、慢病毒载体介导人骨形态发生蛋白2/骨髓间充质干细胞/脱钙骨基质。造模后2,4,8及12周分别处死每组3只兔子,通过苏木精-伊红染色、生物力学分析,X射线检查评价股骨大段缺损修复的情况。结果与结论:(1)X射线示A,B,C,D组均有不同的骨痂修复形成,且Lane-Sandhu X射线评分A慢病毒载体介导人骨形态发生蛋白2/骨髓间充质干细胞/脱钙骨基质后有大量的骨痂形成,良好的生物力学性能,完整的骨皮质,说明支架促进了骨传导、骨诱导和骨生成,对兔股骨大段缺损有较好的修复效果。

关键词：慢病毒属骨形态发生蛋白类间质干细胞组织工程

人AP2β基因慢病毒表达载体的构建及其对肝癌HepG2细胞生长的影响

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军事医学 2020年第2期44卷 105-109页

作者：霍楠马路园朱祥丛瑞初众唐枝亢小峰赵彩彦徐小洁军事科学院军事医学研究院生物工程研究所北京100850 河北医科大学第三医院感染科石家庄071000

目的构建人AP2β基因慢病毒(lentivirus)表达载体,并检测其过表达对肝癌细胞HepG2生长的影响。方法从人乳腺文库中采用PCR技术扩增出人AP2β基因编码序列,并将其插入pCDH载体,获得pCDH-AP2β真核表达载体;将其与包装载体转染293T,包装成... 详细信息

目的构建人AP2β基因慢病毒(lentivirus)表达载体,并检测其过表达对肝癌细胞HepG2生长的影响。方法从人乳腺文库中采用PCR技术扩增出人AP2β基因编码序列,并将其插入pCDH载体,获得pCDH-AP2β真核表达载体;将其与包装载体转染293T,包装成Lenti-AP2β慢病毒并测定病毒滴度,感染肝癌HepG2细胞,Western印迹检测病毒载体介导的AP2β蛋白的表达情况,并进行生长曲线实验研究过量表达AP2β对HepG2细胞生长的影响。结果双酶切和Western印迹表明,pCDH-AP2β真核表达质粒构建成功,包装成滴度为2.5×107PFU/ml的LentiAP2β慢病毒载体;将此慢病毒载体感染HepG2细胞,Western印迹显示,慢病毒载体成功表达AP2β,生长曲线和克隆形成实验结果表明,AP2β过表达可抑制肝癌细胞HepG2的生长。结论构建了AP2β的慢病毒表达载体LentiAP2β,在HepG2细胞中过量表达AP2β可抑制细胞的生长,该实验为进一步研究AP2β在肝癌中的功能奠定了基础。

关键词： AP2β基因慢病毒属载体肝肿瘤 HepG2细胞

核糖体蛋白S3a RNA干扰重组慢病毒载体的构建及其对细胞凋亡的影响

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第二军医大学学报 2015年第9期36卷 947-951页

作者：李英华王婧邱磊厉建中胡振林张俊平第二军医大学药学院生化药学教研室上海200433

目的构建小鼠核糖体蛋白S3a（RPS3a）特异性RNA干扰重组慢病毒载体（Lenti-shmRPS3a）,分析其对细胞凋亡的影响。方法设计针对小鼠RPS3amRNA的4条干扰序列,合成相应的发夹序列,连接入慢病毒载体系统pLLU2GeGFP中构建重组质粒,将重组... 详细信息

目的构建小鼠核糖体蛋白S3a（RPS3a）特异性RNA干扰重组慢病毒载体（Lenti-shmRPS3a）,分析其对细胞凋亡的影响。方法设计针对小鼠RPS3amRNA的4条干扰序列,合成相应的发夹序列,连接入慢病毒载体系统pLLU2GeGFP中构建重组质粒,将重组质粒与辅助包装质粒共转染293T细胞组装病毒,检测病毒滴度。病毒感染RAW264.7细胞后,RT-PCR和蛋白质印迹法检测干扰效果,流式细胞术分析其对凋亡的影响。结果 PCR和测序证明成功构建出LentishmRPS3a慢病毒载体,病毒滴度为（6~9）×107 TU/mL;RT-PCR表明Lenti-shmRPS3a的沉默效率高达72.64%,蛋白质印迹法证明RPS3a蛋白表达水平降低;流式细胞术证明感染了Lenti-shmRPS3a的细胞凋亡率较对照组升高（P〈0.05）。结论表达小鼠RPS3ashRNA的慢病毒载体能有效沉默RPS3a基因表达,促进细胞凋亡。

关键词：核糖体蛋白S3a RNA干扰慢病毒属细胞凋亡

构建靶向Runx2基因成骨样细胞MC3T3-E1慢病毒载体

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中国组织工程研究 2018年第28期22卷 4429-4433页

作者：秦晗龚永庆徐宏志徐州医科大学附属连云港医院口腔科江苏省连云港市222002

背景:研究表明成骨细胞特异性转录因子(Runx2)的杂合突变、基因插入、缺失等是造成颅骨锁骨发育不全的重要原因。目前关于Runx2基因沉默后成骨细胞功能会发生怎样的变化,及如何沉默成骨细胞Runx2基因表达的相关研究未见报道。目的:构建... 详细信息

背景:研究表明成骨细胞特异性转录因子(Runx2)的杂合突变、基因插入、缺失等是造成颅骨锁骨发育不全的重要原因。目前关于Runx2基因沉默后成骨细胞功能会发生怎样的变化,及如何沉默成骨细胞Runx2基因表达的相关研究未见报道。目的:构建靶向Runx2基因的小鼠成骨样细胞MC3T3-E1慢病毒载体,为颅骨锁骨发育不全的研究提供实验依据。方法:根据预实验结果在含5 mg/L Polybrene的ENi.S培养液中,病毒按MOI=40进行感染,按病毒序号分为4组:NC组:pFU-GW-016PSC53349-1;KD1组:LVpFU-GW-016PSC60107-1;KD2组:LVpFU-GW-016PSC60108-1;KD3组:LVpFU-GW-016PSC60109-1。转染后16 h换液,72 h后,Celigo全视野细胞扫描分析仪观察检测基因的表达情况;两步法进行Real-Time PCR检测Runx2基因的沉默效果。结果与结论:(1)病毒转染后72 h,NC组未见荧光表达;KD1组可见少量荧光表达;KD2组荧光表达增强;KD3组可见强绿色荧光;(2)Real-Time PCR结果提示KD3组获得较好Runx2基因沉默效果;(3)实验成功构建靶向Runx2基因的MC3T3-E1细胞慢病毒载体,筛选出特异性抑制成骨细胞Runx2基因的病毒,并初步确定其作用的时间、相应的计量。

关键词：基因成骨细胞慢病毒属转染:组织工程组织构建 Runx2基因 MC3T3-E1细胞慢病毒转染

肾上腺脑白质营养不良蛋白慢病毒载体的构建和表达

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第二军医大学学报 2014年第8期35卷 884-891页

作者：张林富显果林宇翔兰风华王志红厦门大学附属东方医院(南京军区福州总医院)实验科福州350025

目的构建并表达野生型及突变型肾上腺脑白质营养不良蛋白(adrenoleukodystrophy protein,ALDP)的慢病毒载体,探讨ABCD1基因突变对ALDP结构和功能的影响。方法选择ABCD1基因的H283R和P534R两个突变,首先采用生物信息学方法,进行突变致病... 详细信息

目的构建并表达野生型及突变型肾上腺脑白质营养不良蛋白(adrenoleukodystrophy protein,ALDP)的慢病毒载体,探讨ABCD1基因突变对ALDP结构和功能的影响。方法选择ABCD1基因的H283R和P534R两个突变,首先采用生物信息学方法,进行突变致病性及突变体结构稳定性预测;再利用分子克隆技术,将ABCD1基因克隆到pLEX-MCS慢病毒载体,构建野生型慢病毒载体:pLEX-ABCD1,定点诱变构建2个突变型重组载体:pLEX-ABCD1-H283R和pLEXABCD1-P534R,并与其他包装载体共转染293T细胞包装病毒。收集病毒并感染宿主细胞,RT-PCR检测慢病毒感染细胞中野生型与突变型ABCD1 mRNA表达,免疫荧光及蛋白质免疫印迹法分析野生型与突变型ALDP亚细胞定位及表达。结果生物信息学预测显示H283R和P534R为ALD致病性突变;RT-PCR结果显示慢病毒感染细胞中野生型与突变型ABCD1 mRNA均过表达;免疫荧光及蛋白质免疫印迹结果表明,H283R和P534R突变可能导致ALDP突变体表达量下降,但未观察到ALDP定位改变。结论成功构建ABCD1基因慢病毒表达载体,并评估了H283R和P534R突变对ALDP表达及亚细胞定位的影响,为深入研究ALD发病机制提供了实验依据。

关键词： ABCD1基因肾上腺脑白质营养不良蛋白计算生物学慢病毒属