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人α-突触核蛋白基因慢病毒稳定转染PC12细胞系的建立及其凋亡检测

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中华神经科杂志 2011年第9期44卷 602-607页

作者：沈原赵永波刘功禄赵圣杰上海交通大学附属第一人民医院神经科 200080

目的构建及鉴定人野生型和突变型α-突触核蛋白（SNCA和SNCAmu）基因慢病毒表达载体，并观察在体外大鼠嗜铬细胞瘤细胞中的表达。方法在引物合成后采用PCR技术扩增目的基因，并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒[pGC—FU，含绿色荧光蛋白... 详细信息

目的构建及鉴定人野生型和突变型α-突触核蛋白（SNCA和SNCAmu）基因慢病毒表达载体，并观察在体外大鼠嗜铬细胞瘤细胞中的表达。方法在引物合成后采用PCR技术扩增目的基因，并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒[pGC—FU，含绿色荧光蛋白（GFP）基因]中，构建SNCA基因慢病毒载体表达质粒（pGC—FU—SNCA—GFP）和SNCAmu基因慢病毒载体表达质粒（pGC—FU—SNCAmu—GFP），通过酶切、测序验证后，将pGC—FU—SNCA—GFP、pGC—FU—SNCAmu—GFP质粒和包装质粒pHelper1．0、pHelper2．0共同转染大鼠嗜铬细胞瘤细胞（PCI2细胞），获得稳定转染。结果通过检测标签蛋白GFP和目的蛋白，进一步验证pGC—FU—SNCA—GFP和pGC—FU—SNCAmu—GFP在靶细胞中的表达。通过噻唑蓝比色法检测稳定转染后细胞凋亡水平，稳定表达SNCA组（OE组）、SNCAmu组（OEm组）、不加慢病毒质粒的空白对照组（CON组）和加pGC—FU—GFP空载体对照组（NC组）共4组细胞，病毒转染后不同时间（1、2、3、4、5d）细胞增殖变缓（F=4．534、196．285、411．829、1282．049、3135．559，均P〈0．05）。碘化丙锭单染法检测细胞周期，CON组、NC组、OE组和OEm组G1期、G2期和M期细胞百分比差异有统计学意义（F=885．79、45．03、207．11，均P〈0．05），其中G1期细胞百分比（％）较高（CON组：59．10±0．35、NC组：68．24±0．60、OE组：71．73±0．11、OEm组：74．66±0．35）。结论人SNCA和SNCAmu基因转染到PC12细胞中，成功建立稳定表达的细胞系，并且对细胞凋亡水平和细胞周期有一定程度的改变。

关键词： α突触核蛋白慢病毒属转染 PC12细胞细胞凋亡

慢病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／丙氧鸟苷体系抑制人晶状体上皮细胞的研究

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中华眼科杂志 2007年第9期43卷 810-816页

作者：杨晋卢奕郭礼和刘天津莫晓芬复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 200031 中国科学院上海细胞生物学研究所

目的探讨慢病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／丙氧鸟苷体系（HSV—tk／GCV）对人晶状体上皮细胞（LECs）系的杀伤效应的机制。方法HSV—tk基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因共表达的慢病毒感染细胞为试验组，仅表达EGFP的... 详细信息

目的探讨慢病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／丙氧鸟苷体系（HSV—tk／GCV）对人晶状体上皮细胞（LECs）系的杀伤效应的机制。方法HSV—tk基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因共表达的慢病毒感染细胞为试验组，仅表达EGFP的慢病毒感染细胞和正常细胞为对照组。流式细胞仪检测病毒的转染效率，荧光显微镜观察及基因组PCR和RT-PCR检测基因在LECs内表达，DNA ladder和电镜观察该系统对LECs的杀伤作用，检测HSV—tk／GCV系统的浓度时间依赖性和旁观者效应。结果HSV—tk整合入LECs并高效表达。10～25μg／ml的GCV能明显诱导转染HSV—tk的细胞凋亡或坏死，且随GCV浓度升高和作用时间延长效应增强，且存在明显的旁观者效应，而对照组细胞无显著改变。当GCV浓度〉25μg／ml，对照组细胞的增殖也被显著抑制。结论GCV可高效杀伤表达HSV-tk的LECs，且旁观者效应显著增强了HSV—tk／GCV系统的杀伤效果。HSV—tk和EGFP共表达的慢病毒载体能高效稳定转染LECs。

关键词：基因,转基因,自杀慢病毒属发光蛋白质类单纯疱疹病毒属胸苷激酶晶体上皮细胞

慢病毒介导miRNA-184体外转染对人晶状体上皮细胞上皮间质转分化的影响

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中华眼科杂志 2015年第4期51卷 295-300页

作者：徐庆李贞张慧上海建工医院眼科 200083

目的观察慢病毒介导miRNA-184体外转染对TGF-β2诱导人LEC发生上皮间质转分化（EMT）时其基因表型的影响.方法实验研究.构建pL/IRES/GFP-miR-184质粒,经慢病毒介导体外转染由TGF-β2诱导而发生EMT的人LEC,利用QRT-PCR检测转染0、6、2... 详细信息

目的观察慢病毒介导miRNA-184体外转染对TGF-β2诱导人LEC发生上皮间质转分化（EMT）时其基因表型的影响.方法实验研究.构建pL/IRES/GFP-miR-184质粒,经慢病毒介导体外转染由TGF-β2诱导而发生EMT的人LEC,利用QRT-PCR检测转染0、6、24 h后人LEC中相关基因E-钙黏蛋白（CDH1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（VIM）表达水平的变化,并与阴性对照慢病毒侵染组进行比较.采用单因素方差分析进行统计学分析.结果成功构建pL/IRES/GFP-miR-184质粒,经慢病毒介导转染由TGF-β2诱导而发生EMT的人LEC 24 h后,上皮细胞标志性基因CDH1相对表达量保持相对不变,24 h时为6.30E-06,而对照组则下调,24 h时为1.37E-06,差异有统计学意义（F=261.78,P＜0.01）;间质细胞标志性基因α-SMA和VIM的相对表达量均保持相对不变,24 h时分别为1.55E-02和4.61E-04,而对照组则均上调,24 h时分别为2.09E-02和6.73E-04,差异有统计学意义（F=26.21,P=0.007;F=17.91,P=0.013）.结论 miRNA-184经慢病毒介导转染人LEC后,能抑制其由TGF-β2诱导所发生的EMT相关的基因表型变化。

关键词：晶体上皮细胞上皮-间质转化转染慢病毒属

脑源性神经营养因子基因重组慢病毒转染骨髓间质干细胞移植治疗大鼠脑出血的实验研究

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中华神经科杂志 2013年第4期46卷 257-264页

作者：任瑞芳黄良国蒋国红黄名璐施迎兵遵义医学院附属医院神经内科 563000

目的观察脑源性神经营养因子（BDNF）基因重组慢病毒转染骨髓间质干细胞（MSCs）移植治疗大鼠脑出血的疗效。方法分离培养大鼠MSCs；将带有BDNF的慢病毒载体转染MSCs；RT—PCR、蛋白质印迹检测转基因MSCsBDNF基因及蛋白水平表达。制备... 详细信息

目的观察脑源性神经营养因子（BDNF）基因重组慢病毒转染骨髓间质干细胞（MSCs）移植治疗大鼠脑出血的疗效。方法分离培养大鼠MSCs；将带有BDNF的慢病毒载体转染MSCs；RT—PCR、蛋白质印迹检测转基因MSCsBDNF基因及蛋白水平表达。制备大鼠脑出血模型，采用抽签法随机分为磷酸盐缓冲液（PBS）组、MSCs组、空病毒转染骨髓间质干细胞（MSCs—EGFP）组、脑源性神经营养因子基因重组慢病毒转染骨髓问质干细胞（MSCs—***）组，每组15只。72h后细胞移植，记录各组细胞移植后7、14、21d神经功能缺损改善程度；免疫荧光双标检测MSCs脑内迁移和分化情况。结果MSCs—EGFP—BDNF组BDNF基因及蛋白水平表达明显高于MSCs组及MSCs—EGFP组；与PBS组（7d：2．0±0．4，14d：1．7±0．2，21d：1．3±0．2）相比，MSCs组（7d：1．6±0．2，14d：1．2±0．3，21d：0．8±0．2）、MSCs—EGFP组（7d：1．6±0．3，14d：1．1±0．2，21d：0．8±0．3）及MSCs-EGFP—BDNF组（7d：1．2±0．3，14d：0．6±0．1，21d：0．2±0．2）大鼠神经功能评分均有不同程度改善（F=6．667、18．417、20．882，均P〈0．05），其中MSCs—***组改善最为显著；免疫荧光双标显示MSCs-EGFP—BDNF组胶原纤维酸性蛋白、神经元特异性核蛋白、环核苷酸磷酸二酯酶阳性率明显高于MSCs组及MSCs—EGFP组，而MSCs组与MSCs—EGFP组比较差异无统计学意义。结论BDNF基因重组慢病毒修饰的MSCs基因及蛋白水平表达均增高；修饰的MSCs移植后可迁移至脑出血灶周围存活并分化表达神经细胞标志物，促进脑出血后神经功能修复。

关键词：脑源性神经营养因子重组,遗传骨髓移植间质干细胞移植慢病毒属脑出血大鼠

绿色荧光蛋白和胸苷激酶基因共表达的慢病毒载体的构建及表达

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中华眼科杂志 2007年第5期43卷 387-392页

作者：杨晋卢奕郭礼和刘天津莫晓芬复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科上海200031 中国科学院上海细胞生物学研究所

目的构建人巨细胞病毒广谱启动子（CMV）调控的增强绿色荧光蛋白（EGFP）和自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV—tk）共表达的慢病毒载体，获得高效的慢病毒转基因平台。方法采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接等方法，将HSV-tk基... 详细信息

目的构建人巨细胞病毒广谱启动子（CMV）调控的增强绿色荧光蛋白（EGFP）和自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV—tk）共表达的慢病毒载体，获得高效的慢病毒转基因平台。方法采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接等方法，将HSV-tk基因插入慢病毒载体Lenti-ires-EGFP中，构建广谱启动子CMV调控的HSV-tk和EGFP共表达的慢病毒载体（Lenti—CMV-HSV-tk-EGFP）。构建成功后的慢病毒三质粒系统通过磷酸钙沉淀法转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞-293T，28h后收集病毒颗粒，测定病毒滴度，并感染人晶状体上皮细胞株、视网膜母细胞瘤细胞株、神经母细胞株、Hela细胞等，荧光显微镜下观察EGFP的表达。RT-PCR检测HSV-tk与EGFP的表达。结果构建的慢病毒载体Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP能高效转染各类细胞并持续稳定的表达。RT-PCR的结果表明Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP感染细胞能共表达HSV-tk和EGFP，利用该慢病毒载体系统转染人晶状体上皮细胞株时，在复合感染度（MOI）为100时，转染效率接近100％，且传代培养6个月后仍能维持高转染效率。结论成功构建了能转染多种细胞的TK自杀基因和EGFP共表达的慢病毒载体，为眼科自杀基因治疗的实验研究提供高效稳定的转基因技术平台。

关键词：基因,转基因,自杀慢病毒属晶体发光蛋白质类单纯疱疹病毒属胸苷激酶

慢病毒介导的类表皮生长因子域7基因沉默抑制喉癌Hep-2细胞增殖和侵袭的研究

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中华耳鼻咽喉头颈外科杂志 2014年第8期49卷 643-648页

作者：黎景佳叶进庄士民王涛王志远常利红张革化中山大学附属第三医院耳鼻咽喉头颈外科广州510630

目的探讨小干扰RNA（siRNA）重组慢病毒介导的类表皮生长因子域7（epidermal growth factor-like domain 7,EGFL7）基因沉默对体外培养喉癌Hep-2细胞增殖和侵袭潜能的影响.方法采用RNA干扰技术,构建靶向EGFL7的shRNA重组慢病毒并转染H... 详细信息

目的探讨小干扰RNA（siRNA）重组慢病毒介导的类表皮生长因子域7（epidermal growth factor-like domain 7,EGFL7）基因沉默对体外培养喉癌Hep-2细胞增殖和侵袭潜能的影响.方法采用RNA干扰技术,构建靶向EGFL7的shRNA重组慢病毒并转染Hep-2细胞,通过Real-timePCR和Western blot在mRNA及蛋白水平鉴定转染结果;实验分为空白对照组（NC）、空白慢病毒感染组（Lenti-NC）和EGFL7基因沉默慢病毒感染组（Lenti-EGFL7）,采用CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,Transwell侵袭实验观察细胞侵袭能力.结果 Real-time PCR检测说明Lenti-EGFL7组mRNA相对表达量较NC组下降达94％（P＜0.001）,Western blot检测证实Lenti-EGFL7组EGFL7蛋白相对表达量为（0.07 ±0.04）较NC组的（0.39 ±0.12）明显减低（P ＜0.001）,表明成功构建稳定沉默EGFL7基因的喉癌Hep-2细胞株.CCK-8细胞增殖实验说明靶向沉默EGFL7表达导致喉癌细胞增殖明显抑制（P＜0.01）,流式细胞术检测证实,与NC组和Lenti-NC组相比,Lenti-EGFL7组S期细胞百分比明显升高（P＜0.01）,G1期细胞百分比下降（P＜0.05）,细胞凋亡检测证实Lenti-EGFL7组细胞凋亡率为（66.2±1.28）％较NC组的（6.09±3.28）％和Lenti-NC组的（9.86±2.13）％明显增加（P ＜0.001）.Transwell侵袭实验发现Lenti-EGFL7组穿过Matrigel到达下室的平均细胞数较NC组和Lenti-NC组均明显减少（P＜0.01）.结论靶向沉默EGFL7基因能抑制体外培养喉癌Hep-2细胞的增殖并降低细胞侵袭能力.

关键词： RNA,小分子干扰喉肿瘤表皮生长因子细胞增殖肿瘤侵润慢病毒属肿瘤细胞,培养的

肾上腺脑白质营养不良蛋白慢病毒载体的构建和表达

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第二军医大学学报 2014年第8期35卷 884-891页

作者：张林富显果林宇翔兰风华王志红厦门大学附属东方医院(南京军区福州总医院)实验科福州350025

目的构建并表达野生型及突变型肾上腺脑白质营养不良蛋白(adrenoleukodystrophy protein,ALDP)的慢病毒载体,探讨ABCD1基因突变对ALDP结构和功能的影响。方法选择ABCD1基因的H283R和P534R两个突变,首先采用生物信息学方法,进行突变致病... 详细信息

目的构建并表达野生型及突变型肾上腺脑白质营养不良蛋白(adrenoleukodystrophy protein,ALDP)的慢病毒载体,探讨ABCD1基因突变对ALDP结构和功能的影响。方法选择ABCD1基因的H283R和P534R两个突变,首先采用生物信息学方法,进行突变致病性及突变体结构稳定性预测;再利用分子克隆技术,将ABCD1基因克隆到pLEX-MCS慢病毒载体,构建野生型慢病毒载体:pLEX-ABCD1,定点诱变构建2个突变型重组载体:pLEX-ABCD1-H283R和pLEXABCD1-P534R,并与其他包装载体共转染293T细胞包装病毒。收集病毒并感染宿主细胞,RT-PCR检测慢病毒感染细胞中野生型与突变型ABCD1 mRNA表达,免疫荧光及蛋白质免疫印迹法分析野生型与突变型ALDP亚细胞定位及表达。结果生物信息学预测显示H283R和P534R为ALD致病性突变;RT-PCR结果显示慢病毒感染细胞中野生型与突变型ABCD1 mRNA均过表达;免疫荧光及蛋白质免疫印迹结果表明,H283R和P534R突变可能导致ALDP突变体表达量下降,但未观察到ALDP定位改变。结论成功构建ABCD1基因慢病毒表达载体,并评估了H283R和P534R突变对ALDP表达及亚细胞定位的影响,为深入研究ALD发病机制提供了实验依据。

关键词： ABCD1基因肾上腺脑白质营养不良蛋白计算生物学慢病毒属

慢病毒介导RNA干扰Nogo受体基因治疗脊髓损伤的实验研究

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中华外科杂志 2010年第20期48卷 1573-1576页

作者：吕碧涛袁文徐盛明第二军医大学附属长征医院骨科上海200003

目的观察慢病毒介导RNA干扰大鼠神经元Nogo受体（NgR）基因表达对脊髓损伤的修复作用。方法将前期实验中构建好的针对NgR的特异性小干扰RNA系列siNgR199慢病毒重组体，按感染复数=3体外转染已培养好的大鼠皮层神经元细胞。荧光电镜观察... 详细信息

目的观察慢病毒介导RNA干扰大鼠神经元Nogo受体（NgR）基因表达对脊髓损伤的修复作用。方法将前期实验中构建好的针对NgR的特异性小干扰RNA系列siNgR199慢病毒重组体，按感染复数=3体外转染已培养好的大鼠皮层神经元细胞。荧光电镜观察慢病毒重组体的转染效率，采用实时荧光定量PCR检测NgR基因沉默效率，验证慢病毒重组体的有效性。建立大鼠重度脊髓损伤模型，大鼠分组后分别于大脑皮层运动区注射生理盐水、慢病毒重组体，采用BBB评分法观测大鼠后肢运动恢复情况，采用神经示踪法观察脊髓损伤区神经纤维生长情况。结果慢病毒重组体体外转染神经元细胞的效率〉99％，NgR基因沉默效率为61％。大鼠模型给药后8周，慢病毒重组体组大鼠脊髓损伤区可观察到神经纤维生长通过，而生理盐水组大鼠脊髓损伤区未见神经纤维生长通过，BBB评分结果提示慢病毒重组体组大鼠后肢运动功能恢复优于生理盐水组（P〈0．01）。结论慢病毒siNgR199重组体能够促进脊髓损伤区神经纤维的生长，在一定程度上促进脊髓损伤后大鼠后肢运动功能恢复。

关键词：慢病毒属 RNA干扰脊髓损伤 Nogo受体

趋化因子受体3 RNA干扰慢病毒载体的构建及对嗜酸粒细胞作用的初步研究

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中华耳鼻咽喉头颈外科杂志 2013年第4期48卷 316-321页

作者：朱新华廖兵王心悦刘轲刘月辉南昌大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科 330006

目的构建趋化因子受体3（chemokine receptor3，CCR3）基因RNA干扰（RNA interference，RNAi）慢病毒表达载体，了解其对嗜酸粒细胞的作用。方法针对小鼠CCR3基因序列，设计出RNAi的靶序列，退火形成双链DNA，与经MluI、SacI、EcoRI、Hi... 详细信息

目的构建趋化因子受体3（chemokine receptor3，CCR3）基因RNA干扰（RNA interference，RNAi）慢病毒表达载体，了解其对嗜酸粒细胞的作用。方法针对小鼠CCR3基因序列，设计出RNAi的靶序列，退火形成双链DNA，与经MluI、SacI、EcoRI、HindIll、BamHI和XhoI进行酶切后的pLVX—shRNA2一m载体连接产生短发夹RNA（shoa hairpin RNA，shRNA）慢病毒载体。应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及嗜酸粒细胞，测定病毒滴度，实时定量聚合酶链反应检测嗜酸粒细胞中CCR3基因mRNA的表达情况。结果成功构建了shRNA—mCCR3慢病毒载体，经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90％，病毒滴度为4×10。TU／ml；对嗜酸粒细胞CCR3基因沉默效率为86．7％。结论成功构建CCR3基因RNAi慢病毒表达载体，为后续感染嗜酸粒细胞，探索其在变应性鼻炎发生和发展中的作用奠定了基础。

关键词： RNA干扰受体 CCR3 慢病毒属嗜酸细胞