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多肽微阵列筛选技术在肺结核诊断中的应用

医学分子生物学杂志 2018年第1期15卷 35-39页

作者：谭金晶顾勐张丽娜王玥李伟英首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所细胞生物学研究室北京市101149

目的血清免疫学技术广泛用于肺结核检测，但已有的血清标志物其敏感性和特异性还有待提高，需要发掘新的血清标志物。方法利用多肽微阵列技术解析结核菌抗原PPE—FAMILY（RV2430e），SodC（Rv0432）和TrxC（Rv3913）全长蛋白质多肽序列... 详细信息

目的血清免疫学技术广泛用于肺结核检测，但已有的血清标志物其敏感性和特异性还有待提高，需要发掘新的血清标志物。方法利用多肽微阵列技术解析结核菌抗原PPE—FAMILY（RV2430e），SodC（Rv0432）和TrxC（Rv3913）全长蛋白质多肽序列，获得蛋白抗原表位多肽。进行两轮筛选，寻找结核病优势抗原多肽。利用ELISA进行验证，并将多肽与融合全蛋白进行检测效能的比较。结果筛选和验证出一条来自TrxC的抗原多肽。用于ELISA检测肺结核的敏感性和特异性分别是65％和80％，ROC曲线下面积为0．789，比用融合蛋白检测效果更优。结论多肽微阵列在寻找新的肺结核血清标志物方面具有很强的应用前景。

关键词：多肽微阵列肺结核血清标志物抗原表位 TrxC

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多肽微阵列筛选技术在肺结核诊断中的应用

结核病与胸部肿瘤 2018年第3期 176-180页

作者：谭金晶顾勐张丽娜王玥李伟英首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所细胞生物学研究室 101149

目的血清免疫学技术广泛用于肺结核检测，但已有的血清标志物其敏感性和特异性还有待提高，需要发掘新的血清标志物。方法利用多肽微阵列技术解析结核菌抗原PPE．FAMILY（RV2430c），SodC（Rv0432）和TrxC（Rv3913）全长蛋白质多肽序列... 详细信息

目的血清免疫学技术广泛用于肺结核检测，但已有的血清标志物其敏感性和特异性还有待提高，需要发掘新的血清标志物。方法利用多肽微阵列技术解析结核菌抗原PPE．FAMILY（RV2430c），SodC（Rv0432）和TrxC（Rv3913）全长蛋白质多肽序列，获得蛋白抗原表位多肽。进行两轮筛选，寻找结核病优势抗原多肽。利用ELISA进行验证，并将多肽与融合全蛋白进行检测效能的比较。结果筛选和验证出一条来自TrxC的抗原多肽，用于ELISA检测肺结核的敏感性和特异性分别是65％和80％，ROC曲线下面积为O．789，比用融合蛋白检测效果更优。结论多肽微阵列在寻找新的肺结核血清标志物方面具有很强的应用前景。

关键词：多肽微阵列肺结核血清标志物抗原表位 TrxC

血清p53自身抗体对胶质瘤诊断与预后判断价值探讨

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中华肿瘤防治杂志 2017年第17期24卷 1214-1219页

作者：周珂黄煜伦张学文韩笑笑姚辉张海兵周幽心江苏省靖江市人民医院神经外科江苏靖江214500 苏州大学附属第一医院神经外科江苏苏州215006

目的脑胶质瘤目前尚缺乏血清学的指标用于早期诊断以及判断预后。本研究拟探索胶质瘤患者血清中p53自身抗体表达在胶质瘤诊断和预后判断中的价值。方法选取苏州大学附属第一医院2013-01-01-2014-12-30收治的48例脑胶质瘤患者的肿瘤组织... 详细信息

目的脑胶质瘤目前尚缺乏血清学的指标用于早期诊断以及判断预后。本研究拟探索胶质瘤患者血清中p53自身抗体表达在胶质瘤诊断和预后判断中的价值。方法选取苏州大学附属第一医院2013-01-01-2014-12-30收治的48例脑胶质瘤患者的肿瘤组织和血清作为研究对象,选取同期38例正常人血清为对照。采用多肽微阵列纳米芯片技术检测患者血清中p53自身抗体对多肽的响应,聚合酶链反应(PCR)检测组织中p53mRNA的表达,免疫组织化学法检测组织中p53蛋白的表达水平。结果 48例胶质瘤血清样本中,p53自身抗体的信号噪声比(signal noise ratio,SNR)总值为19.05±22.21,高于正常人群的7.08±5.75。p53自身抗体的胶质瘤诊断cut-off值为18.58,ROC曲线下面积为0.63。48例患者中p53自身抗体阳性率37.5%,38名正常对照p53自身抗体阳性率2.6%。p53自身抗体对胶质瘤诊断的敏感性为37.50%,特异性为97.36%。p53自身抗体在不同级别的胶质瘤中无明显差异。p53自身抗体与p53mRNA水平以及免疫组化中的p53蛋白表达未见明显相关性。对48例胶质瘤患者进行随访发现,p53自身抗体阳性的患者较阴性的患者有较长的生存时间,差异有统计学意义,P多肽微阵列技术检测血清p53自身抗体在胶质瘤诊断有一定的作用。对于胶质瘤患者术后的随访以及预后判断具有较大的价值。

关键词： p53 自身抗体胶质瘤诊断预后多肽微阵列

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多肽芯片技术在药物筛选中的应用研究

中国现代药物应用 2023年第3期17卷 174-177页

作者：赵媛贺倩谢永臻张为梁柏堂药明激创(佛山)生物科技有限公司 528000

由蛋白芯片技术发展而来的多肽芯片,正成为生物学和化学中高通量方法的有力工具。多肽芯片上高度集成上千成万的肽片段,具有高度的特异性,只需微量的样本即可快速获得各项生理学信息。多肽芯片已广泛应用于抗体表位筛选、蛋白质结构与... 详细信息

由蛋白芯片技术发展而来的多肽芯片,正成为生物学和化学中高通量方法的有力工具。多肽芯片上高度集成上千成万的肽片段,具有高度的特异性,只需微量的样本即可快速获得各项生理学信息。多肽芯片已广泛应用于抗体表位筛选、蛋白质结构与功能研究、酶与底物相互作用等。同时,多肽芯片在新药开发、药物筛选、药物分析等方面具有重大的应用前景。

关键词：多肽芯片多肽微阵列药物筛选

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慢性HBV感染患者HLA-DR等位特异性CD4+T细胞表位研究

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慢性HBV感染患者HLA-DR等位特异性CD4+T细胞表位研究

作者：李辉文第三军医大学

学位级别：硕士

背景:HBV病毒是导致肝损伤及肝炎最常见的病毒,其中有超过90%的婴幼儿感染及3%-5%的成年人感染者最终发展成为慢性HBV感染。宿主的T细胞免疫应答对HBV感染结局起着非常重要的作用。而CD4+T细胞是宿主T细胞免疫应答的重要环节。随着CD4+... 详细信息

背景:HBV病毒是导致肝损伤及肝炎最常见的病毒,其中有超过90%的婴幼儿感染及3%-5%的成年人感染者最终发展成为慢性HBV感染。宿主的T细胞免疫应答对HBV感染结局起着非常重要的作用。而CD4+T细胞是宿主T细胞免疫应答的重要环节。随着CD4+T研究的深入,发现其亚型较多,不同的不同的亚群功能不一样,甚至对同一细胞亚群,不同研究的得出的结论也不一致,这可能与HBV病毒表位的不同及宿主HLA-Ⅱ类分子的多态性有关。为此,HBV病毒特异CD4+T细胞的研究必须深入到HBV表位及HLA-Ⅱ类分子等位上,结合我们前期发现HLA-DR*0803偏向于免疫保护,而HLA-DR*1202偏向于免疫损伤,从功能上我们设想是不同的HLA-DR等位可能是通过识别的不同的抗原表位、对CD4+T细胞不同的分化偏向等层面来实现不同的免疫应答。目的:比较HLA-DR*0803/1202两个等位之间的HBV全蛋白表位差异,两个等位对CD4+T细胞极化效应的差异。材料方法:本课题结合了质谱鉴定、微阵列芯片表位作图及功能实验等方法。首先利用NCBI确定HBV病毒B、C基因型P、S、X、C蛋白共有序列后,合成HBV核心抗原肽池(长15个氨基酸,重叠10个氨基酸,共41条肽),定制包含P、S、X、C蛋白微阵列芯片(长15个氨基酸,重叠11个氨基酸,共631条肽)。然后用肽池负载基因型HLA-DR*0803及HLA-DR*1202等位的BLCL后,用等渗的柠檬酸酸性缓冲液将细胞表面结合的肽段洗脱下来,经过过滤、脱盐、真空浓缩等处理后进行液质联用质谱分析,通过选取IonScore≥20的HBc Ag肽段,结合Net MHCIIpan 3.0 Server预测工具,选取IonScore≥20且IC50≤500的多肽,并分析肽池来源,确定HLA-DR限制性的HBcAg表位。同时,免疫磁珠法提取纯化HLA-DR分子,一方面从HLA-DR分子上将多肽送去质谱鉴定,另一方面用HLA-DR分子与定制的微阵列芯片进行检测、扫描。最后,从质谱与芯片检测的结果中选出其中4条肽(芯片检测的prec21-35、HBc12-26、质谱鉴定的HBc82-96、不应答对照HBc42-56)来观察4例同型HLA-DR慢性HBV患者的T细胞应答实验。结果:1.质谱鉴定结合Net MHCIIpan 3.0 Server预测,我们发现HLA-DR*0803限制性的有HBc17-31,HBc22-36,HBc27-41,HBc82-96,HBc87-101,HBc92-106,HBc117-131,HBc122-136等8条,HLA-DR*1202限制性的有HBc17-31,HBc22-36,HBc27-41,HBc82-96,HBc87-101,HBc92-106,HBc122-136,HBc137-151,HBc142-156等9条。相同的有7条。2.从提取纯化BLCL表面的HLA-DR分子上分离得到肽中,质谱鉴定只发现了2条HBc Ag肽,但我们发现了数百条源自热休克蛋白、转铁蛋白受体蛋白1、组织蛋白酶D、基质金属蛋白酶抑制剂等数十个蛋白的人自身抗原肽。3.从HLA-DR分子与微阵列芯片进行检测结果中,发现HLA-DRB1*0803限制性的206条,HLA-DRB1*1202限制性的169条,总共260条,因其中有115条是相同的。其中HBc Ag肽分别为31及28条,23条是相同的。芯片扫描结果与质谱分析结果相比,HBc82-96,HBc87-101,HBc92-106,HBc137-151,HBc142-156等肽段在芯片中对应位置中没有荧光值,已知的8条HBcAg表位,只有HBc 147-156不在芯片结果显示区域。4.我们收集了9例慢性HBV患者的PBMC,检测得到基因型HLA-DRB1*0803及DRB1*1202阳性的病人各2例(2/9)。用prec21-35、HBc12-26、HBc42-56、HBc82-96对筛选的4例慢性HBV患者进行应答实验发现,HBc12-26刺激在两例患者中出现了强烈IFN-γ释放反应,1例未出现明显应答反应,1例未做该肽的刺激实验。其余肽都未出现明显的T细胞应答反应。此外,用HBcAg全肽池刺激比运用单条肽刺激明显产生强烈的IL-17释放反应。结论:表位肽芯片效果相对较好,质谱分析可靠,结合生物信息方法的辅助,更具有目的性;HBc12-26为HLA-DR*0803/1202共同的Th1表位,HBc42-56为HLA-DR*1202等位特异的Th2表位,HBc Ag肽池中存在HLA-DR*0803/1202特异的Th17表位。

关键词：慢性HBV HLA-DR 质谱多肽微阵列 CD4+T 表位

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阵列技术应用于非小细胞肺癌诊疗的研究

阵列技术应用于非小细胞肺癌诊疗的研究

作者：祁松楠苏州大学

学位级别：硕士

目的探讨新型固体支撑材料改性聚二甲基硅氧烷(Integrated Poly(dimethysiloxane),i PDMS)多肽微阵列和蛋白微阵列技术应用于非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)诊疗的研究。方法第一部分对p53和EGFR胞外段的序列进行叠瓦... 详细信息

目的探讨新型固体支撑材料改性聚二甲基硅氧烷(Integrated Poly(dimethysiloxane),i PDMS)多肽微阵列和蛋白微阵列技术应用于非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)诊疗的研究。方法第一部分对p53和EGFR胞外段的序列进行叠瓦式切割,构建高内涵精细多肽库,建立i PDMS多肽微阵列检测方案;对150例NSCLC患者和96例健康对照者进行血清p53和EGFR多肽自身抗体的大规模筛选;应用传统生物信息学手段进行分析研究,确定血清p53和EGFR自身抗体所识别的线性抗原表位位点,探讨其潜在的研究价值。第二部分采用i PDMS蛋白微阵列法定量检测50例NSCLC患者、50例健康对照者血清IL-6、IL-8、MCP-1、GM-CSF的水平,结合NSCLC患者不同临床病理参数进行分析。结果第一部分p53和EGFR多肽的自身抗体既存在于NSCLC患者血清中,也存在于健康对照组的血清中,微阵列芯片表达差异显著分析(Significance analysis of microarrays,SAM)显示在NSCLC组和健康对照组血清中存在针对4条p53多肽和2条EGFR多肽的差异表达的自身抗体,这6条多肽的自身抗体在NSCLC患者血清的响应明显高于健康对照组(P多肽进行受试者工作特征曲线(Receiver operator characteristic curve,ROC)分析发现多指标联合的诊断模型具有更高的诊断效率,由此得到了一个由p53-02,p53-04,p53-05和EGFR-48构成的多指标联合诊断模型,该组合模型在特异度为90%时能达到36.7%的灵敏度。线性抗原位点分析发现,血清p53自身抗体的主要识别氨基端(N端)和羧基端(C端)的线性表位,而非中央热点突变区,而血清EGFR自身抗体识别的高频位点集中分布在EGFR胞外段L2和S2结构域。第二部分与健康对照组相比,NSCLC患者血清IL-6、IL-8、GM-CSF水平显著升高(P0.05);与无淋巴结转移的患者相比,有淋巴结转移的患者血清IL-6水平升高(P0.05);与肺鳞癌患者相比,肺腺癌患者血清IL-8水平升高(P0.05)。结论1.NSCLC组和健康对照组之间存在差异性表达的p53和EGFR多肽自身抗体,可通过i PDMS多肽微阵列技术加以检测。基于p53和EGFR多肽库的NSCLC诊断模型展示出了一定的临床应用前景。i PDMS多肽微阵列技术为p53和EGFR线性表位的精细定位研究提供了强有力的工具。2.血清IL-6、IL-8、MCP-1、GM-CSF水平的改变与NSCLC的发生、发展密切相关,其血清学定量检测不仅有助于了解NSCLC患者的免疫功能状态,而且对NSCLC分期、分型具有一定参考价值。3.i PDMS微阵列技术小型化、高通量、多指标、低成本的特点为免疫学研究提供了极大的方便,具有一定的科研和临床应用前景。

关键词： iPDMS 多肽微阵列蛋白微阵列 NSCLC 自身抗体细胞因子

MGMT自身抗体指导胶质母细胞瘤化疗的临床价值探讨

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MGMT自身抗体指导胶质母细胞瘤化疗的临床价值探讨

作者：钱兴龙苏州大学

学位级别：硕士

目的：06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因编码769bp的全长cDNA序列,含一个621bp的开放性阅读框架,编码207个氨基酸,相对分子质量为22ku,其活性位点在145位的半胱氨酸残基上,可在无条件下催化DNA分子中鸟嘌呤06位上的烷基并将其转移... 详细信息

目的：06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因编码769bp的全长cDNA序列,含一个621bp的开放性阅读框架,编码207个氨基酸,相对分子质量为22ku,其活性位点在145位的半胱氨酸残基上,可在无条件下催化DNA分子中鸟嘌呤06位上的烷基并将其转移至MGMT第145位的半胱氨酸残基上,使鸟嘌呤损伤修复,DNA的结构和功能得以恢复,同时MGMT在转甲基后将不可逆地失去活性。目前,还没有发现其他蛋白质可参与此过程,正是这种原理使替莫唑胺(Temozolomide TMZ)的化疗失去效果。本研究基于多肽微阵列(polypeptide Microarray)新技术探索多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme GBM)患者血清中耐药基因MGMT自身抗体(AutoAntibody)在化疗中的价值。方法：以28例人脑胶质瘤组织,其中胶质母细胞瘤(GMB)20例,星形细胞瘤8例,以及4例人正常脑组织为研究对象,分别采用多肽微阵列技术检测患者血清中MGMT自身抗体对多肽的响应、甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation-specific PCR MSP)检测组织中MGMT基因启动子区甲基化情况、免疫组织化学(Immunohistochemistry IHC)法检测组织中MGMT蛋白的表达情况。结果：28例胶质瘤标本中,MGMT自身抗体对多肽响应9例,未响应19例,响应率为32.1%;MGMT基因启动子区甲基化10例,去甲基化18例;MGMT蛋白表达阳性14例,阴性14例。4例正常脑组织中MGMT自身抗体对多肽均未响应,启动子区均为去甲基化,蛋白表达均阴性。其中在20例胶质母细胞瘤患者中,MGMT自身抗体对多肽的响应结果与启动子区甲基化状态呈正相关(r=0.579,P多肽有响应。在20例胶质母细胞瘤患者中,MGMT多肽微阵列及免疫组化检测结果与MSP检测结果存在明显的相关性,多肽微阵列技术检测血清MGMT自身抗体在预测胶质母细胞瘤患者对替莫唑胺耐药性上有一定的作用,通过检测患者外周血清MGMT肽段的自身抗体来判断胶质母细胞瘤患者对替莫唑胺的敏感性,不仅解决了由于无法获取肿瘤组织进行分子和病理学检查而导致的对病人化疗的盲目性,也能够判断患者是否在化疗进程中继发出现了对替莫唑胺的耐药。

关键词：多形性胶质母细胞瘤 O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶替莫唑胺多肽微阵列自身抗体

血清p53自身抗体与胶质瘤的临床恶性程度以及预后的相关性研究

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血清p53自身抗体与胶质瘤的临床恶性程度以及预后的相关性研究

作者：周珂苏州大学

学位级别：硕士

目的：P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因。血清P53自身抗体是机体对突变型P53蛋白的免疫应答的产物。本研究采用多肽微阵列(Polypeptide Microarray)新技术探索胶质瘤患者血清中P53自身抗体(Autoantibody)表达与临床恶性程... 详细信息

目的：P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因。血清P53自身抗体是机体对突变型P53蛋白的免疫应答的产物。本研究采用多肽微阵列(Polypeptide Microarray)新技术探索胶质瘤患者血清中P53自身抗体(Autoantibody)表达与临床恶性程度以及预后的相关性。方法：以48例脑胶质瘤患者的肿瘤组织及血清以及20例正常人血清为研究对象,分别采用多肽微阵列技术检测患者血清中P53自身抗体对多肽的响应、聚合酶链反应(PCR)检测组织中P53 mRNA的表达,免疫组织化学(Immunohistochemistry IHC)法检测组织中P53蛋白的表达情况。结果：48例胶质瘤血清样本中,Ⅰ-Ⅱ级胶质瘤患者13例,其中对的P53自身抗体的高反应者4例占30.8%;Ⅲ级胶质瘤患者24例,其中P53自身抗体高反应者10例,占41.7%;Ⅳ级胶质瘤患者11例,其中P53自身抗体高反应者1例,占8.3%;正常人20例,P53自身抗体高反应者1例,占5%。不同级别的胶质瘤和正常人中有明显差异。P53自身抗体与P53mRNA水平以及免疫组化中的P53蛋白表达未见明显相关性。对48例胶质瘤患者进行随访,其中失访4例,有14例死亡,最短随访时间3月,最长随访时间34月。发现P53自身抗体高表达的患者较低表达的患者有较长的生存时间,有明显的统计学差异。结论：初步断定正常人血清中有P53自身抗体者比率较少,而胶质瘤患者血清中P53自身抗体对P53多肽响应明显,其中以P53-8最为常见,且信号噪声比(Signal Noise Ratio SNR)值较高。多肽微阵列技术检测血清P53自身抗体在预测胶质瘤临床恶性程度及预后有一定的作用。检测患者外周血清P53自身抗体方便快捷,可以动态多次的进行检测。对于胶质瘤患者术后的随访以及预后的判断具有较大的价值。

关键词： P53 胶质瘤多肽微阵列自身抗体

HPV-16多肽在前列腺癌患者血清抗体筛查中的应用

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现代泌尿生殖肿瘤杂志 2016年第5期8卷 292-295,297页

作者：周政孙玉峰郭帅浦金贤赵晓俊苏州大学附属第一医院泌尿外科 215006

目的探讨HPV-16感染与前列腺癌的相关性及基于HPV-16多肽微阵列芯片在前列腺癌患者血清筛查中的应用。方法对来自HPV-16病毒的7个蛋白的胞外段序列进行叠瓦式切割,构建基于241条精细多肽库的微阵列芯片,对经病理确诊的72例前列腺癌患者... 详细信息

目的探讨HPV-16感染与前列腺癌的相关性及基于HPV-16多肽微阵列芯片在前列腺癌患者血清筛查中的应用。方法对来自HPV-16病毒的7个蛋白的胞外段序列进行叠瓦式切割,构建基于241条精细多肽库的微阵列芯片,对经病理确诊的72例前列腺癌患者和87例前列腺增生患者行血清学筛查。用微阵列芯片表达差异显著分析法筛选在前列腺癌患者和前列腺增生患者血清中具有差异性表达的多肽(特异性多肽);以受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve,ROC)评价这些多肽对前列腺癌的诊断价值,并与PSA相比较。结果HPV-16多肽在两组血清中的抗体响应不同,与HPV-16多肽反应的自身抗体既存在于前列腺癌患者中,也存在于前列腺增生患者中。其中存在15条多肽,与之响应的抗体在两组血清中呈差异性表达;对这15条具有潜在诊断价值的多肽进行ROC曲线分析,发现多指标联合的诊断模型具有更高的诊断效率,由15条多肽构成的多指标联合诊断模型ROC曲线下面积为0.772,在最佳临界值的诊断灵敏度为75.3%,特异度为61.8%;PSA的ROC曲线下面积为0.770,在最佳临界值的诊断灵敏度为65.3%,特异度83.9%。结论前列腺癌患者血清中存在HPV-16特异性自身抗体,并可通过HPV-16多肽微阵列技术加以检测。

关键词：前列腺癌 HPV-16 多肽微阵列

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