慢性HBV感染患者HLA-DR等位特异性CD4+T细胞表位研究

作     者：李辉文 

作者单位：第三军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邓国宏

授予年度：2015年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学] 

主      题：慢性HBV HLA-DR 质谱 多肽微阵列 CD4+T 表位 

摘      要：背景:HBV病毒是导致肝损伤及肝炎最常见的病毒,其中有超过90%的婴幼儿感染及3%-5%的成年人感染者最终发展成为慢性HBV感染。宿主的T细胞免疫应答对HBV感染结局起着非常重要的作用。而CD4+T细胞是宿主T细胞免疫应答的重要环节。随着CD4+T研究的深入,发现其亚型较多,不同的不同的亚群功能不一样,甚至对同一细胞亚群,不同研究的得出的结论也不一致,这可能与HBV病毒表位的不同及宿主HLA-Ⅱ类分子的多态性有关。为此,HBV病毒特异CD4+T细胞的研究必须深入到HBV表位及HLA-Ⅱ类分子等位上,结合我们前期发现HLA-DR*0803偏向于免疫保护,而HLA-DR*1202偏向于免疫损伤,从功能上我们设想是不同的HLA-DR等位可能是通过识别的不同的抗原表位、对CD4+T细胞不同的分化偏向等层面来实现不同的免疫应答。目的:比较HLA-DR*0803/1202两个等位之间的HBV全蛋白表位差异,两个等位对CD4+T细胞极化效应的差异。材料方法:本课题结合了质谱鉴定、微阵列芯片表位作图及功能实验等方法。首先利用NCBI确定HBV病毒B、C基因型P、S、X、C蛋白共有序列后,合成HBV核心抗原肽池(长15个氨基酸,重叠10个氨基酸,共41条肽),定制包含P、S、X、C蛋白微阵列芯片(长15个氨基酸,重叠11个氨基酸,共631条肽)。然后用肽池负载基因型HLA-DR*0803及HLA-DR*1202等位的BLCL后,用等渗的柠檬酸酸性缓冲液将细胞表面结合的肽段洗脱下来,经过过滤、脱盐、真空浓缩等处理后进行液质联用质谱分析,通过选取IonScore≥20的HBc Ag肽段,结合Net MHCIIpan 3.0 Server预测工具,选取IonScore≥20且IC50≤500的多肽,并分析肽池来源,确定HLA-DR限制性的HBcAg表位。同时,免疫磁珠法提取纯化HLA-DR分子,一方面从HLA-DR分子上将多肽送去质谱鉴定,另一方面用HLA-DR分子与定制的微阵列芯片进行检测、扫描。最后,从质谱与芯片检测的结果中选出其中4条肽(芯片检测的prec21-35、HBc12-26、质谱鉴定的HBc82-96、不应答对照HBc42-56)来观察4例同型HLA-DR慢性HBV患者的T细胞应答实验。结果:1.质谱鉴定结合Net MHCIIpan 3.0 Server预测,我们发现HLA-DR*0803限制性的有HBc17-31,HBc22-36,HBc27-41,HBc82-96,HBc87-101,HBc92-106,HBc117-131,HBc122-136等8条,HLA-DR*1202限制性的有HBc17-31,HBc22-36,HBc27-41,HBc82-96,HBc87-101,HBc92-106,HBc122-136,HBc137-151,HBc142-156等9条。相同的有7条。2.从提取纯化BLCL表面的HLA-DR分子上分离得到肽中,质谱鉴定只发现了2条HBc Ag肽,但我们发现了数百条源自热休克蛋白、转铁蛋白受体蛋白1、组织蛋白酶D、基质金属蛋白酶抑制剂等数十个蛋白的人自身抗原肽。3.从HLA-DR分子与微阵列芯片进行检测结果中,发现HLA-DRB1*0803限制性的206条,HLA-DRB1*1202限制性的169条,总共260条,因其中有115条是相同的。其中HBc Ag肽分别为31及28条,23条是相同的。芯片扫描结果与质谱分析结果相比,HBc82-96,HBc87-101,HBc92-106,HBc137-151,HBc142-156等肽段在芯片中对应位置中没有荧光值,已知的8条HBcAg表位,只有HBc 147-156不在芯片结果显示区域。4.我们收集了9例慢性HBV患者的PBMC,检测得到基因型HLA-DRB1*0803及DRB1*1202阳性的病人各2例(2/9)。用prec21-35、HBc12-26、HBc42-56、HBc82-96对筛选的4例慢性HBV患者进行应答实验发现,HBc12-26刺激在两例患者中出现了强烈IFN-γ释放反应,1例未出现明显应答反应,1例未做该肽的刺激实验。其余肽都未出现明显的T细胞应答反应。此外,用HBcAg全肽池刺激比运用单条肽刺激明显产生强烈的IL-17释放反应。结论:表位肽芯片效果相对较好,质谱分析可靠,结合生物信息方法的辅助,更具有目的性;HBc12-26为HLA-DR*0803/1202共同的Th1表位,HBc42-56为HLA-DR*1202等位特异的Th2表位,HBc Ag肽池中存在HLA-DR*0803/1202特异的Th17表位。