检索结果-南通市图书馆

塞内卡病毒A（SVA）VP1与宿主BAD互作激活线粒体凋亡通路的分子机制研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

塞内卡病毒A（SVA）VP1与宿主BAD互作激活线粒体凋亡通路的分子机...

作者：王咏中国农业科学院

学位级别：硕士

细胞凋亡（Apoptosis）是机体为保障自身稳态平衡通过调控基因表达使细胞发生自主有次序的死亡过程。病毒感染引起的细胞凋亡是宿主为抵御病原体复制和扩散的防御机制。如果细胞凋亡发生在子代病毒组装过程中,则宿主会利用免疫监视和防... 详细信息

细胞凋亡（Apoptosis）是机体为保障自身稳态平衡通过调控基因表达使细胞发生自主有次序的死亡过程。病毒感染引起的细胞凋亡是宿主为抵御病原体复制和扩散的防御机制。如果细胞凋亡发生在子代病毒组装过程中,则宿主会利用免疫监视和防御功能及时将子代病毒吞噬并排除体外。因此很多病毒会通过某种机制来抑制宿主死亡,以期保证病毒能在宿主内稳定存活。相反,当病毒完成装配后,又会利用宿主的促凋亡机制进而扩散其子代病毒。塞内卡病毒A（Senecavirus A,SVA）是目前塞内卡病毒属唯一成员,它是无囊膜、单股正链小RNA病毒。2002年SVA初次在培养人胎儿视网膜细胞的培养基内被发现。猪作为SVA的易感动物,感染后表现为,吻突或口腔粘膜处会发生完整或破裂的小泡,并且蹄部出现水泡破裂而致使跛行。同时,新生仔猪感染SVA后会发生急性死亡。SVA作为小核糖核酸病毒科的一类新病原,感染宿主后对宿主细胞凋亡产生调控作用不清楚。通过HE染色和石蜡切片荧光TUNEL实验发现,SVA能够引起宿主组织产生明显病理变化,并出现明显的细胞凋亡。为探究SVA对宿主细胞凋亡的作用,首先通过显微镜观察,发现SVA感染能引起PK-15和HEK293T细胞产生明显的细胞病变。通过qPCR实验和流式细胞术检测发现SVA能够在293T细胞中复制,并且与对照相比SVA能显著性的诱导293T细胞凋亡。其次通过Western Blotting及流式细胞术筛选SVA各蛋白表明,SVA结构蛋白VP1具有诱导细胞凋亡功能且呈剂量依赖性。最后,为进一步探索SVA-VP1诱导细胞凋亡的分子机制,通过Annexin-V-FITC/PI染色荧光观察发现,VP1能使细胞发生早期和晚期细胞凋亡。免疫共沉淀、间接免疫荧光以及线粒体分离实验发现,SVA-VP1亚细胞定位于线粒体,并且与促凋亡蛋白BAD在线粒体上发生相互作用。通过瞬时转染BAD表明,BAD能促进VP1诱导的细胞凋亡。然而采用siRNA干扰技术敲低BAD后,VP1诱导凋亡的功能显著性降低。Western Blotting以及qPCR试验检测发现,VP1能够促进BAD及其下游蛋白BAX的表达及Caspase3的剪切活化,但对上游蛋白AKT、JNK及其的磷酸化无影响。而将BAD敲低后,VP1对BAX和Caspase3蛋白水平和mRNA水平的促进作用消失了。通过qPCR检测还发现,在SVA感染细胞后期,BAD能够促进SVA的复制。以上实验表明,VP1依赖于BAD激活线粒体凋亡通路,且BAD促进SVA复制。本研究表明,细胞在感染SVA后,通过其结构蛋白VP1与促凋亡蛋白BAD在线粒体上特异性互作,并依赖于BAD促进促凋亡蛋白BAX和Caspase3的表达及活化,最终导致细胞出现凋亡。本结果有助于揭示SVA利用宿主蛋白影响宿主细胞凋亡及自身复制的分子机制,为更深入的揭示SVA的致病机制提供理论依据。

关键词：塞内卡病毒A 细胞凋亡 VP1 BAD 机制

塞内卡病毒A致病性与VP2间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

塞内卡病毒A致病性与VP2间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

作者：周而璇南京农业大学

学位级别：硕士

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA),又称为塞内卡谷病毒(Seneca Valley Virus,SVV)。中文翻译名称又有塞内卡谷病毒、塞尼卡病毒和塞内加病毒,是造成猪水疱病影响我国养猪业一种新型重要病毒。SVA感染可引起仔猪突发死亡和育肥猪嗜睡、厌... 详细信息

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA),又称为塞内卡谷病毒(Seneca Valley Virus,SVV)。中文翻译名称又有塞内卡谷病毒、塞尼卡病毒和塞内加病毒,是造成猪水疱病影响我国养猪业一种新型重要病毒。SVA感染可引起仔猪突发死亡和育肥猪嗜睡、厌食、口鼻部和蹄部出现囊泡、溃疡、结痂等症状,给养殖业出口带来一定影响。自2015年中国广东首次报道猪场感染SVA以来,我国湖北、黑龙江、福建等多省份猪场水疱病病例报道日益增加,逐渐引起国内学者的关注。本研究通过对不同日龄猪临床感染塞内卡病毒A,观察了感染病毒后的临床症状,研究了中和抗体、病毒血症、结构蛋白抗体随感染时间的变化规律,同时对间接ELISA抗体检测方法进行了优化,进行了不同省份2016-2019年血清学调查。本研究的具体内容如下:1.塞内卡病毒A分离毒株SVV-CH-SD对猪的致病性研究为了明确SVA山东省分离毒株SVV-CH-SD的致病特性,本研究选取40头30-35、55-65和90-100日龄三个日龄段的SVA阴性健康猪,将20头30-35日龄和55-65日龄猪分别随机分为2组,每组5头,即30-35日龄感染组、30-35日龄对照组;55-65日龄感染组、55-65日龄对照组。将20头90-100日龄SVA阴性健康猪随机分为4组,每组5头,即90-100日龄滴鼻攻毒组、90-100日龄口鼻攻毒组、90-100日龄蹄部肌注组和90-100日龄对照组。攻毒剂量为10ml SVV-CH-SD/头(109TCID50/mL),攻毒后隔离饲养28d,每日记录临床症状。攻毒后第0、3、7、14、21和28d采血测定病毒血症、中和抗体和ELISA抗体。攻毒后第28天处死所有猪只,观察肉眼病理变化并收集感染组心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、口腔液和腹股沟淋巴结,确定各脏器病毒载量。结果为:3个日龄段猪攻毒后仅有各别猪出现体温升高,90-100日龄猪三个攻毒组中7头猪出现水疱病特征病变,但所有试验猪未出现死亡,且脏器无特异性病变,实时荧光定量PCR检测,攻毒猪心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、口腔液和淋巴结中均检测到SVA;血清中病毒血症在攻毒后第3天达到顶峰,随后快速下降、直至第28天完全消退;血清中和抗体在攻毒后第14天达到峰值,并持续至试验结束,各攻毒组之间无显著差异。SVAVP1、VP2、VP3、VP4蛋白ELISA抗体在攻毒后第14天达到峰值,并持续至试验结束。本试验成功构建了 SVA人工感染猪体发病模型,证明SVV-CH-SD分离株可以感染30-100日龄猪,对90-100日龄猪有临床致病作用,病毒感染后可产生明显病毒血症,多个组织器官带毒。随着病毒抗体的产生,病毒血症水平逐渐降低,为该病毒致病机制研究和疫病防控奠定了基础。2.塞内卡病毒A VP2蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用本研究采用RT-PCR方法,从SVV-CH-SD毒株扩增获得VP2基因片段,克隆至pET-32a(+)表达质粒,基因测序分析鉴定正确。将其转化至感受态细胞BL21(DE3)上,并进行诱导表达。结果证明,重组菌株可以表达抗原性良好的分子量大小为55 kDa的融合蛋白。以纯化的VP2蛋白作为包被抗原,经过系列条件优化,建立了 SVAVP2间接ELISA抗体检测方法。本方法特异性好,与五种常见猪流行病病毒阳性血清均无反应。本方法敏感性为91.6%,符合率为91.9%,批间重复试验、批内重复试验结果均在14%以内,显示本方法重复性好。将该方法用于检测2016年～2019年福建、江苏、安徽、浙江、山东、河南、辽宁、江西、山西、天津、河北和湖南等12个省份2828份猪血清,抗体阳性率72.7%,华东、华北和华中地区抗体阳性率分别为70.8%、90.6%、74.6%,2016年抗体阳性率最高为87.1%。该方法特异性、敏感性和重复性较好,可用于SVA抗体检测和流行病学调查研究。

关键词：塞内卡病毒A 致病性 VP2 ELISA 流行病学

调控塞内卡病毒A感染的关键磷酸化修饰蛋白的鉴定与功能研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

调控塞内卡病毒A感染的关键磷酸化修饰蛋白的鉴定与功能研究

作者：黎洁怡中国农业科学院

学位级别：硕士

塞内卡病毒病是由塞内卡病毒A（Seneca virus A,SVA）引起的一种主要感染猪的病毒性传染病,对养猪业造成威胁。SVA作为猪新发的传染病病原,其致病机制尚不清楚。磷酸化是一种广泛的翻译后修饰,调节多种生物学过程。病毒感染可以改变宿... 详细信息

塞内卡病毒病是由塞内卡病毒A（Seneca virus A,SVA）引起的一种主要感染猪的病毒性传染病,对养猪业造成威胁。SVA作为猪新发的传染病病原,其致病机制尚不清楚。磷酸化是一种广泛的翻译后修饰,调节多种生物学过程。病毒感染可以改变宿主细胞的生理活性,从而促进病毒的复制,调控蛋白的磷酸化是其机制之一。鉴定调控SVA感染的关键磷酸化修饰蛋白、研究其在SVA感染过程中的功能和作用机制,有助于理解SVA与宿主的相互作用机制,在蛋白质翻译后修饰水平上揭示SVA的感染机制。1、通过非标定量和磷酸化修饰富集技术以及高分辨率液相色谱-质谱联用的定量蛋白质组学技术,在SVA感染IBRS-2细胞前后两组样本中共鉴定到2794个蛋白上的9034个磷酸化修饰位点,其中2084个蛋白上的4520个位点具有定量信息。以差异变化倍数1.5倍为阈值（t-test pvalue＜0.05）,筛选到150个蛋白上的180个磷酸化位点修饰下调,58个蛋白上的63个磷酸化位点修饰下调。Gene Ontology（GO）功能富集、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集和亚细胞结构定位分析表明,所鉴定到的磷酸化蛋白大多与细胞凋亡、剪接体途径有关,主要定位于位于细胞核内。对具有差异磷酸化修饰位点对应蛋白的基序分析表明,脯氨酸（P）,天冬氨酸（D）和谷氨酸（E）是丝氨酸（S）基序富集分析中富集到最多的氨基酸残基,而P、E和精氨酸（R）是苏氨酸（T）基序富集结果中富集到最多的残基。最后,通过激酶分析共预测到了165个激酶,9个激酶的活性发生了逆转,其中CDK2激酶活性上升。2、通过基于质谱的靶向蛋白质组定量技术（PRM）对前期鉴定到的27个蛋白质上的40个磷酸化位点进行定量确认,最终定量到21个蛋白质中的30个磷酸化位点,排除与磷酸化蛋白质组学结果不一致的位点,最后有17个蛋白上的25个位点与磷酸化蛋白质组学结果相符。结合生物信息学分析和文献查阅,其中SRRM2,CDK13,DDX20,DDX21,BAD,ELAVL1,PBK和STAT3可能在SVA感染中发挥作用。进一步通过Western blot（WB）方法对CDC5L、STAT3、CDK2这三个蛋白进行验证,结果与磷酸化蛋白质组学结果一致。3、通过STAT3的特异性抑制剂Stattic和CDK2的特异性抑制剂CVT-313对靶标蛋白STAT3和CDK2在SVA感染过程中的功能进行初步研究。细胞活率检测试验发现添加了抑制剂（Stattic或CVT-313）的IBRS-2细胞比不添加抑制剂的IBRS-2细胞在SVA感染后细胞活率有显著增高。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,Stattic或CVT-313均能引起SVA感染后凋亡细胞的减少。SVA的定量PCR和WB检测发现,Stattic或CVT-313均可促进SVA的复制。进一步通过WB检测和激酶活性检测发现Stattic可抑制STAT3蛋白的S727位点和T705位点的磷酸化而不影响STAT3的表达;而CVT-313抑制CDK2的酶活性而不影响其蛋白的表达,表明Stattic通过抑制STAT3蛋白的S727和Y705位点磷酸化发挥作用,CVT-313通过下调CDK2的酶活性发挥作用。结合磷酸化蛋白质组学的结果推测,SVA可能通过抑制STAT3蛋白的S727位点磷酸化,促进其复制。而SVA感染后CDK2酶活性上升可能是宿主细胞抵抗SVA感染的一种防御机制。

关键词：磷酸化塞内卡病毒A STAT3 CDK2 CDC5L

塞内卡病毒A分离鉴定及其诱导细胞自噬的分子机制研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

塞内卡病毒A分离鉴定及其诱导细胞自噬的分子机制研究

作者：王晶河北农业大学

学位级别：硕士

塞内卡病毒A（SenecavirusA,SVA）是小RNA病毒科塞内卡病毒属中的唯一成员,其临床症状主要为水泡性病变和吻部及蹄部冠状带合并糜烂,与FMDV、SVDV和VSV感染的症状相似。SVA自在我国出现以来,已在多个省市传播和流行,给养殖业带来了严重... 详细信息

塞内卡病毒A（SenecavirusA,SVA）是小RNA病毒科塞内卡病毒属中的唯一成员,其临床症状主要为水泡性病变和吻部及蹄部冠状带合并糜烂,与FMDV、SVDV和VSV感染的症状相似。SVA自在我国出现以来,已在多个省市传播和流行,给养殖业带来了严重的经济损失。因此,探究病毒与宿主细胞之间的作用关系,了解机体细胞防御机制抗SVA情况,将为SVA致病机制提供理论基础。自噬是一种自我保护和防御机制,对维持细胞内稳态具有重要作用。研究表明,自噬与病原体感染有着密切的联系,其对病毒在宿主细胞内增殖具有双重作用。为了探究SVA与自噬的关系,我们展开并获得了以下研究工作和结果:（1）本研究对临床上收集的样品进行PCR扩增,结果成功获得一份SVA阳性样品。用PK-15细胞对SVA进行分离,盲传至第10代可见明显的细胞病变,根据 Reed-Muench 方法得到 TCID50 为 1 0-5.776/0.1 mL。透射电镜、IFA 和 RT-PCR结果可见病毒粒子和特异性荧光斑点,以及不同代次的目的条带,证明利用PK-15细胞成功分离到一株SVA,并命名为SVAHB-BD。（2）为了确定SVA是否诱导细胞发生自噬,通过透射电镜、激光共聚焦、Western blot、RT-qPCR和IFA方法观察到SVA感染后双层膜结构的形成,并可见自噬体向溶酶体的转化,且显著上调了 LC3蛋白和ATG5和Beclin-1基因的表达（P＜0.05）。在CQ作用下得到SVA感染显著增加了 p62蛋白的表达量（P＜0.05）,说明SVA促进了一个完整的自噬过程。此外,UV-SVA感染细胞不能诱导自噬,证明SVA诱导自噬需要病毒复制。（3）为了确定SVA结构蛋白VP2对自噬的影响,本研究构建了 VP2基因真核表达载体。随后,Western blot、IFA和RT-qPCR结果得到SVA结构蛋白VP2显著上调了 LC3蛋白的表达（P＜0.05）,并提高了基因转录水平,初步证明SVA结构蛋白VP2可以诱导细胞自噬的发生。（4）为了确定细胞自噬对SVA增殖的影响,本研究利用Rapamycin、3-MA和CQ预处理细胞,在Western blot和RT-qPCR结果中发现Rapamycin抑制了病毒在PK-15细胞中增殖,而3-MA和CQ均促进了病毒复制。此外,利用RNAi干扰LC3和Beclin-1基因后促进了病毒增殖,证明自噬抑制了SVA增殖。（5）为了进一步探明SVA诱导自噬的分子机制,SVA感染不同时间后均显著提高了蛋白的表达。为进一步验证SVA感染对信号通路的影响,利用AICAR预处理细胞,结果显著提高了通路蛋白的表达,证明SVA通过AMPK-mTOR通路诱导了自噬发生。综上所述,本研究成功分离到一株SVA;证明SVA感染PK-15细胞可以诱导自噬;SVA VP2可诱导自噬的发生;自噬负调控SVA增殖;SAV通过AMPK-mTOR信号通路诱导PK-15细胞自噬。

关键词：塞内卡病毒A 自噬结构蛋白VP2 病毒增殖 AMPK-mTOR信号通路

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

塞内卡病毒A对新生仔猪死亡率的影响

国外畜牧学（猪与禽） 2019年第12期39卷 1-1,2,3页

作者：孟含(译) 张配配(校) 马晓迪(制图) Daniel Linhares 不详艾奥瓦州立大学诊断实验室

巴西和美国中西部地区的猪病例报告指出在新生仔猪死亡病例中鉴定出塞内卡病毒A(Seneca Virus A,SVA),本文总结有关SVA和最近介绍的新生仔猪死亡综合征的最新认识。

关键词：塞内卡病毒A 新生仔猪水疱病

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

掌握塞内卡病毒A的流行病学

国外畜牧学（猪与禽） 2019年第12期39卷 4-4,5页

作者：孟霞(译) 夏俊花(校) Guilherme Preis 不详明尼苏达大学兽医学院兽医医学系

进一步了解塞内卡病毒A的传播和发病规律能够揭示它的流行病学特征,这有助于猪场制定预防和控制猪感染塞内卡病毒A的措施。

关键词：塞内卡病毒A 水疱病流行病学

更好的塞内卡病毒检测手段将提供更好的监测工具

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

国外畜牧学（猪与禽） 2019年第12期39卷 7-7,8页

作者：韩浩月陈权 Russ Daly Steve Lawson 美国南达科他州立大学

抗体检测技术的发展能够为猪场兽医在监测猪塞内卡病毒A的流行上提供一种新工具。

关键词：塞内卡病毒A 抗体检测监测

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

提高猪的免疫力有助于净化塞内卡病毒A

国外畜牧学（猪与禽） 2019年第12期39卷 5-5,6页

作者：张文华(译) 张配配(校) Matthew Sturos Fabio Vannucci 不详美国明尼苏达大学兽医学院兽医种群医学系

一旦塞内卡病毒A在不同猪场之间的传播被阻断,就可以对环境中的塞内卡病毒A进行灭活。

关键词：塞内卡病毒A 生物安全监测

CHO细胞表达重组猪干扰素-γ及其抗病毒活性

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

生物工程学报 2023年第12期39卷 4784-4795页

作者：王凌云郝荣增杨洋李亚军卢炳州毛玉涵张越龚真莉刘艳红齐萌茹毅郑海学中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046 塔里木大学动物科学与技术学院新疆阿拉尔843300

为利用中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovarian,CHO)细胞表达系统制备重组猪干扰素-γ(recombinant porcine interferon gamma,rPoIFN-γ),并分析其体外抗病毒活性,本研究首先构建rPoIFN-γ真核表达质粒pc DNA3.1-PoIFN-γ,转染悬浮培养的CHO细胞,进行上清分泌表达,利用亲和层析纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定;通过CCK-8实验分析rPoIFN-γ对细胞的毒性,用VSV/PK-15系统检测其抗病毒活性效价;最后分析rPoIFN-γ对塞内卡病毒A(Seneca virus A,SVA)的抗病毒活性及其对细胞内干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)和细胞因子的诱导作用。结果显示,本研究利用CHO悬浮细胞表达系统成功制备了纯化的rPoIFN-γ,该rPoIFN-γ对细胞无毒性,VSV/PK-15系统检测其活性效价为5.59×10^(7) U/mg;此外,rPoIFN-γ可诱导细胞内多种ISGs和细胞因子的表达,并显著抑制SVA的复制。总之,本研究成功利用CHO表达系统制备了高活性的rPoIFN-γ,并在体外完成其对SVA的抗病毒作用分析,为rPoIFN-γ的功能及抗病毒制剂的研究提供了实验材料和基础。

关键词：猪干扰素-γ 塞内卡病毒A 中国仓鼠卵巢(CHO)细胞蛋白表达与纯化抗病毒活性