塞内卡病毒A分离鉴定及其诱导细胞自噬的分子机制研究

作     者：王晶 

作者单位：河北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：范京惠

授予年度：2021年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：塞内卡病毒A 自噬 结构蛋白VP2 病毒增殖 AMPK-mTOR信号通路 

摘      要：塞内卡病毒A（SenecavirusA,SVA）是小RNA病毒科塞内卡病毒属中的唯一成员,其临床症状主要为水泡性病变和吻部及蹄部冠状带合并糜烂,与FMDV、SVDV和VSV感染的症状相似。SVA自在我国出现以来,已在多个省市传播和流行,给养殖业带来了严重的经济损失。因此,探究病毒与宿主细胞之间的作用关系,了解机体细胞防御机制抗SVA情况,将为SVA致病机制提供理论基础。自噬是一种自我保护和防御机制,对维持细胞内稳态具有重要作用。研究表明,自噬与病原体感染有着密切的联系,其对病毒在宿主细胞内增殖具有双重作用。为了探究SVA与自噬的关系,我们展开并获得了以下研究工作和结果:（1）本研究对临床上收集的样品进行PCR扩增,结果成功获得一份SVA阳性样品。用PK-15细胞对SVA进行分离,盲传至第10代可见明显的细胞病变,根据 Reed-Muench 方法得到 TCID50 为 1 0-5.776/0.1 mL。透射电镜、IFA 和 RT-PCR结果可见病毒粒子和特异性荧光斑点,以及不同代次的目的条带,证明利用PK-15细胞成功分离到一株SVA,并命名为SVAHB-BD。（2）为了确定SVA是否诱导细胞发生自噬,通过透射电镜、激光共聚焦、Western blot、RT-qPCR和IFA方法观察到SVA感染后双层膜结构的形成,并可见自噬体向溶酶体的转化,且显著上调了 LC3蛋白和ATG5和Beclin-1基因的表达（P0.05）。在CQ作用下得到SVA感染显著增加了 p62蛋白的表达量（P0.05）,说明SVA促进了一个完整的自噬过程。此外,UV-SVA感染细胞不能诱导自噬,证明SVA诱导自噬需要病毒复制。（3）为了确定SVA结构蛋白VP2对自噬的影响,本研究构建了 VP2基因真核表达载体。随后,Western blot、IFA和RT-qPCR结果得到SVA结构蛋白VP2显著上调了 LC3蛋白的表达（P0.05）,并提高了基因转录水平,初步证明SVA结构蛋白VP2可以诱导细胞自噬的发生。（4）为了确定细胞自噬对SVA增殖的影响,本研究利用Rapamycin、3-MA和CQ预处理细胞,在Western blot和RT-qPCR结果中发现Rapamycin抑制了病毒在PK-15细胞中增殖,而3-MA和CQ均促进了病毒复制。此外,利用RNAi干扰LC3和Beclin-1基因后促进了病毒增殖,证明自噬抑制了SVA增殖。（5）为了进一步探明SVA诱导自噬的分子机制,SVA感染不同时间后均显著提高了蛋白的表达。为进一步验证SVA感染对信号通路的影响,利用AICAR预处理细胞,结果显著提高了通路蛋白的表达,证明SVA通过AMPK-mTOR通路诱导了自噬发生。综上所述,本研究成功分离到一株SVA;证明SVA感染PK-15细胞可以诱导自噬;SVA VP2可诱导自噬的发生;自噬负调控SVA增殖;SAV通过AMPK-mTOR信号通路诱导PK-15细胞自噬。