调控塞内卡病毒A感染的关键磷酸化修饰蛋白的鉴定与功能研究

作     者：黎洁怡 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：张永光

授予年度：2021年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：磷酸化 塞内卡病毒A STAT3 CDK2 CDC5L 

摘      要：塞内卡病毒病是由塞内卡病毒A（Seneca virus A,SVA）引起的一种主要感染猪的病毒性传染病,对养猪业造成威胁。SVA作为猪新发的传染病病原,其致病机制尚不清楚。磷酸化是一种广泛的翻译后修饰,调节多种生物学过程。病毒感染可以改变宿主细胞的生理活性,从而促进病毒的复制,调控蛋白的磷酸化是其机制之一。鉴定调控SVA感染的关键磷酸化修饰蛋白、研究其在SVA感染过程中的功能和作用机制,有助于理解SVA与宿主的相互作用机制,在蛋白质翻译后修饰水平上揭示SVA的感染机制。1、通过非标定量和磷酸化修饰富集技术以及高分辨率液相色谱-质谱联用的定量蛋白质组学技术,在SVA感染IBRS-2细胞前后两组样本中共鉴定到2794个蛋白上的9034个磷酸化修饰位点,其中2084个蛋白上的4520个位点具有定量信息。以差异变化倍数1.5倍为阈值（t-test pvalue0.05）,筛选到150个蛋白上的180个磷酸化位点修饰下调,58个蛋白上的63个磷酸化位点修饰下调。Gene Ontology（GO）功能富集、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集和亚细胞结构定位分析表明,所鉴定到的磷酸化蛋白大多与细胞凋亡、剪接体途径有关,主要定位于位于细胞核内。对具有差异磷酸化修饰位点对应蛋白的基序分析表明,脯氨酸（P）,天冬氨酸（D）和谷氨酸（E）是丝氨酸（S）基序富集分析中富集到最多的氨基酸残基,而P、E和精氨酸（R）是苏氨酸（T）基序富集结果中富集到最多的残基。最后,通过激酶分析共预测到了165个激酶,9个激酶的活性发生了逆转,其中CDK2激酶活性上升。2、通过基于质谱的靶向蛋白质组定量技术（PRM）对前期鉴定到的27个蛋白质上的40个磷酸化位点进行定量确认,最终定量到21个蛋白质中的30个磷酸化位点,排除与磷酸化蛋白质组学结果不一致的位点,最后有17个蛋白上的25个位点与磷酸化蛋白质组学结果相符。结合生物信息学分析和文献查阅,其中SRRM2,CDK13,DDX20,DDX21,BAD,ELAVL1,PBK和STAT3可能在SVA感染中发挥作用。进一步通过Western blot（WB）方法对CDC5L、STAT3、CDK2这三个蛋白进行验证,结果与磷酸化蛋白质组学结果一致。3、通过STAT3的特异性抑制剂Stattic和CDK2的特异性抑制剂CVT-313对靶标蛋白STAT3和CDK2在SVA感染过程中的功能进行初步研究。细胞活率检测试验发现添加了抑制剂（Stattic或CVT-313）的IBRS-2细胞比不添加抑制剂的IBRS-2细胞在SVA感染后细胞活率有显著增高。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,Stattic或CVT-313均能引起SVA感染后凋亡细胞的减少。SVA的定量PCR和WB检测发现,Stattic或CVT-313均可促进SVA的复制。进一步通过WB检测和激酶活性检测发现Stattic可抑制STAT3蛋白的S727位点和T705位点的磷酸化而不影响STAT3的表达;而CVT-313抑制CDK2的酶活性而不影响其蛋白的表达,表明Stattic通过抑制STAT3蛋白的S727和Y705位点磷酸化发挥作用,CVT-313通过下调CDK2的酶活性发挥作用。结合磷酸化蛋白质组学的结果推测,SVA可能通过抑制STAT3蛋白的S727位点磷酸化,促进其复制。而SVA感染后CDK2酶活性上升可能是宿主细胞抵抗SVA感染的一种防御机制。