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添加甲萘醌促进嗜热子囊菌合成过氧化氢酶

过程工程学报 2005年第3期5卷 337-340页

作者：王明星李寅方芳华兆哲陈坚江南大学工业生物技术教育部重点实验室生物工程学院环境生物技术研究室江苏无锡214036

研究了添加甲萘醌对嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)IFO9862合成过氧化氢酶(CAT)的影响.结果表明,添加甲萘醌有助于促进CAT的合成.在发酵的24或48h分别添加1μmol/L的甲萘醌,发酵终了CAT酶活比对照分别提高了11.0%和23.1%;而在发酵... 详细信息

研究了添加甲萘醌对嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)IFO9862合成过氧化氢酶(CAT)的影响.结果表明,添加甲萘醌有助于促进CAT的合成.在发酵的24或48h分别添加1μmol/L的甲萘醌,发酵终了CAT酶活比对照分别提高了11.0%和23.1%;而在发酵的36和48h各添加1μmol/L的甲萘醌,CAT酶活可提高32.5%.在发酵0h添加88mmol/L的H2O2,同时在48h添加1μmol/L的甲萘醌,CAT酶活达到1725U/mL,比对照(1074U/mL)提高了60.6%.

关键词：过氧化氢酶甲萘醌过氧化氢嗜热子囊菌

嗜热子囊菌热稳定多糖单加氧酶的基因克隆、表达及其性质研究

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嗜热子囊菌热稳定多糖单加氧酶的基因克隆、表达及其性质研究

作者：陈铭山东农业大学

学位级别：硕士

木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源,目前,我国每年产生约有6亿废弃木材和农作物秸秆,但是人们通常用焚烧的方式处理秸秆,不能被有效利用起来,这种方式不仅浪费了资源,加重了环境污染,增加大气中二氧化碳的含量使温室效应加剧。木质... 详细信息

木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源,目前,我国每年产生约有6亿废弃木材和农作物秸秆,但是人们通常用焚烧的方式处理秸秆,不能被有效利用起来,这种方式不仅浪费了资源,加重了环境污染,增加大气中二氧化碳的含量使温室效应加剧。木质纤维素生物质可以被用热化学处理法来除去木质素,使半纤维素和纤维素组分松散,木质纤维素可以被各种纤维素水解酶分解,产生单体糖,然后将其发酵成乙醇。在植物细胞壁中,半纤维素与木质素以共价键连接,纤维素内包含着微纤丝核心,外部包围着半纤维素形成的基质层,这种结构进一步阻碍了纤维素分解酶和半纤维素分解酶的水解作用。因此,如何高效率低成本利用木质纤维素是我们目前面临的重大难题。嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)是一类可在高温环境中生存的真菌,在40～50℃的条件下生长繁殖,从嗜热真菌中分离的热稳定酶,在未来的工业生产中具有广泛的应用前景。多糖单加氧酶(Polysaccharide monooxygenases,PMOs)是一类含铜氧化酶,在还原型辅因子(如维生素C)存在下可使纤维素分子氧化降解。本研究以嗜热子囊菌为材料,提取真菌菌丝的DNA,已知两个PMO蛋白序列,PMO4983和PMO8913,我们对两条序列进行分析后,发现两个PMO蛋白序列均含有信号肽,因此两个蛋白都是胞外分泌蛋白,PMO4983和PMO8913的两条序列分别编码228和333个氨基酸(不含信号肽),蛋白分子量预测分别为24.33KDa和34.67KDa。设计特异引物以DNA为模板扩增得到PMO基因序列,利用基因重组的方法构建pPICZαA-PMO表达载体,利用电击转化法将重组质粒pPICZαA-PMO转入毕赤酵母GS115并进行博来霉素抗性筛选,筛选出具有高拷贝数的阳性转化子后进行工程菌发酵以及甲醇诱导分泌蛋白,获得异源表达重组蛋白。发酵进行到第七天时收集发酵液,用硫酸铵沉淀法分离蛋白,然后用PBSA缓冲液透析两天后离心,去除杂质得到粗酶。将粗酶用HisTrapTM FF镍柱层析的方法进行洗脱,在起峰时收集蛋白,将目的蛋白分离纯化出来。然后用SDS-PAGE的方法检测蛋白纯度以及分子量大小,结果显示均为单一组分,PMO4983和PMO8913实际分子量大小分别为40.0KDa和60.1KDa。将重组蛋白分离纯化并鉴定后,进行进一步酶学性质检测以及氧化性检测。实验发现,以磷酸膨胀纤维素为反应底物,这两种多糖单加氧酶都没有水解纤维素的能力,但是在维生素C为还原剂的条件下,PMO4983能够将纤维素氧化裂解为纤维寡糖,然而PMO8913的氧化活性并不明显,因而PMO8913的性质还有待进一步鉴定。而在下一步实验中,我们不但证明了PMO4983具有氧化裂解的性质,初步确定了其氧化裂解方式,同时,我们还证明了PMO4983具有提高纤维素水解酶水解活性的能力。在二价铜离子以及维生素C的环境中,用PMO4983将底物处理48h后,与传统纤维素酶混合均匀,能够发现PMO4983可以不同程度地提高纤维素酶的水解活性。

关键词：嗜热子囊菌多糖单加氧酶氧化裂解木质纤维素

嗜热子囊菌光孢变种超氧化物歧化酶（Mn-SOD）基因的克隆、表达及性质研究

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嗜热子囊菌光孢变种超氧化物歧化酶（Mn-SOD）基因的克隆、表达及...

作者：宋宁宁山东农业大学

学位级别：硕士

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,简称SOD)(EC.1.***.1.1)系一类金属酶,广泛存在于生物体中。它能够催化超氧阴离子(O2.-)发生歧化反应,从而清除超氧阴离子。在生物体防御氧化损伤的过程中,发挥着重要作用。根据酶分子中所含金属辅... 详细信息

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,简称SOD)(EC.1.***.1.1)系一类金属酶,广泛存在于生物体中。它能够催化超氧阴离子(O2.-)发生歧化反应,从而清除超氧阴离子。在生物体防御氧化损伤的过程中,发挥着重要作用。根据酶分子中所含金属辅基的不同,超氧化物歧化酶主要可分为Cu,Zn-SOD(存在于真核生物中),Mn-SOD(存在于原核生物和真核生物中),Fe-SOD(存在于原核生物和高等植物的叶绿体中)等类型。Mn-SOD和Fe-SOD的氨基酸组成相似,可能起源于同一祖先。嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)是一种分布广泛、生长上限温度较高的真菌。它能够产生热稳定的具有重要工业价值的超氧化物歧化酶,但是野生菌产酶存在培养温度高等较多不利因素,因而近年来主要研究方向集中于采用基因工程方法构建重组菌,进而表达获得超氧化物歧化酶。本研究中T. aurantiacus在添加干酪素的诱导培养基上产生了超氧化物歧化酶。根据本实验室已克隆的Mn-SOD编码基因设计特异引物,综合运用PCR、RT-PCR技术克隆到编码Mn-SOD基因的cDNA序列,将该基因命名为mnsod。全长cDNA序列为878bp,包含一个编码231个氨基酸的开放阅读框,前35个氨基酸构成信号肽。序列在Genbank中注册,登录号为EF428323。将基因mnsod与酵母分泌型表达载体pPIC9K双酶切后体外连接,构建酵母重组表达载体pPIC9K/mnsod并测序,保证正确的阅读框。将重组表达质粒pPIC9K/mnsod和pPIC9K空质粒分别用限制性内切酶SacⅠ(位于5’AOX1区内)线性化后,采用电击法转化Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞,于MD/MM平板上筛选His+Mut+表型的酵母转化子。经过PCR检测及G418抗性筛选多拷贝整合子,进行甲醇诱导培养。通过检测各转化子每隔24h的蛋白表达情况来筛选高效表达目的超氧化物歧化酶的工程菌株。筛选到表达酶活性最高的菌株MS18,甲醇诱导均为7d酶活性达到最高,酶蛋白表达量为0.92 mg/mL。表达的超氧化物歧化酶通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析等步骤获得了凝胶电泳条带均一的超氧化物歧化酶。SDS-PAGE测得的超氧化物歧化酶单亚基的分子量为21.7kDa。表达超氧化物歧化酶的最适pH值为7.5,最适反应温度为60℃。在pH值为7.5的条件下,该酶在50℃和60℃时保温1h是基本稳定的,在70℃时保温1h后,仍保留有65%的酶活性;在80℃时,酶的半衰期约为40min。在pH值为6.5～9.0之间表达超氧化物歧化酶保持稳定的酶活性。T. aurantiacus超氧化物歧化酶基因能在重组的毕赤酵母中分泌出具有生物活性的目的蛋白,而且表达产物有较好的热稳定性,这预示了重组Mn-SOD在生物学领域和化工工业的广阔应用前景。

关键词：嗜热子囊菌热稳定超氧化物歧化酶 cDNA克隆表达

嗜热子囊菌产过氧化氢酶的生产、固定化及应用研究

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嗜热子囊菌产过氧化氢酶的生产、固定化及应用研究

作者：谢雪凤浙江工业大学

学位级别：硕士

本文所研究的过氧化氢酶是由嗜热子囊菌胞外分泌产生。过氧化氢酶是一种能够高效催化分解过氧化氢的酶,广泛应用于食品消毒、临床分析、医学诊断以及纺织、造纸、制浆等工业。本文对嗜热子囊菌发酵生产过氧化氢酶的条件进行了优化,所产... 详细信息

本文所研究的过氧化氢酶是由嗜热子囊菌胞外分泌产生。过氧化氢酶是一种能够高效催化分解过氧化氢的酶,广泛应用于食品消毒、临床分析、医学诊断以及纺织、造纸、制浆等工业。本文对嗜热子囊菌发酵生产过氧化氢酶的条件进行了优化,所产粗酶经初步分离纯化后,研究其酶学性质。利用大孔吸附树脂对过氧化氢酶进行固定化,研究其最优固定化条件、固定化酶性质,并对其去除HO的应用做了研究。对摇瓶发酵条件进行优化,结果表明,最优种子培养条件是:碳源为玉米淀粉,氮源为蛋白胨,转速200r/min,装液量200mL(500mL摇瓶),培养52h。在基础发酵阶段,最优条件为:10m/L的乙醇、20g/L的糊精为混合碳源,氮源为10g/L的蛋白胨,发酵培养基的初始pH为7.0,摇瓶装液量为90mL(500mL摇瓶),分阶段控制摇床转速,酶活力最高达2267U/mL。在3L发酵罐中发酵时,最优的发酵条件为:接种量6%(v/v),搅拌转速200rpm,从发酵24h开始,每12h添加一次乙醇,每次添加量为2mL(总添加量16mL)。发酵时间延长至116h,酶活最高达到2532U/mL。采用过滤-超滤-硫酸铵盐析-透析等步骤对粗酶液进行初步的分离纯化,研究酶学性质。结果表明,粗酶液经过分离纯化以后,酶活回收率达到了59.3%,蛋白回收率30.2%,比酶活为4608U/mg蛋白,纯化了1.96倍。酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为7.0,具有良好的耐热耐碱性能。向发酵超滤酶液中添加一定量的甘油或者明胶,可以提高酶的贮藏稳定性。选择AB-8大孔吸附树脂作为固定化载体,戊二醛作为交联剂,最优固定化条件为:吸附温度35℃,pH7.0,吸附时间6h,加酶量970U/g(载体),戊二醛终浓度0.2%,交联时间2h,交联温度4℃。在此条件下固定化过氧化氢酶的酶活收率达到45.2%。固定化酶的最适反应温度为35℃,最适反应pH7.0。固定化酶的热稳定性,酸碱稳定性都较游离酶有了一定的提高,且具有较好的操作稳定性及贮藏稳定性,固定化酶重复使用10次,酶活仍能稳定保持在初始酶活的60%以上。游离酶和固定化酶对HO都有很好的去除效果,在20min内能将HO完全去除。

关键词：嗜热子囊菌过氧化氢酶分离纯化固定化去除过氧化氢的应用

嗜热子囊菌产耐热木聚糖酶的条件及酶学性质的研究

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嗜热子囊菌产耐热木聚糖酶的条件及酶学性质的研究

作者：王美娟江苏大学

学位级别：硕士

木聚糖酶主要以内切方式随机作用于木聚糖主链骨架的β-1,4-糖苷键,生成低聚木糖和木糖,现已在食品、饲料、纺织等领域应用广泛。与常温木聚糖酶相比,耐高温木聚糖酶具有催化效率高、防止污染、降低成本等优势,已成为国内外研究的热点之... 详细信息

木聚糖酶主要以内切方式随机作用于木聚糖主链骨架的β-1,4-糖苷键,生成低聚木糖和木糖,现已在食品、饲料、纺织等领域应用广泛。与常温木聚糖酶相比,耐高温木聚糖酶具有催化效率高、防止污染、降低成本等优势,已成为国内外研究的热点之一,而嗜热真菌是主要的耐热木聚糖酶生产菌株。因此,本论文首先从高温堆肥和温泉等处的土壤中筛选出嗜热产耐热木聚糖酶的菌株,对其进行鉴定、培养条件优化,进而对其所产的耐热木聚糖酶进行分离纯化和酶学性质解析。主要的研究结论如下:(1)以江苏句容高温堆肥和湖北咸宁热泉出水口等处的土壤为原料,采用稀释涂布、刚果红染色以及胞外酶活测定的方法,筛选到编号为M1-M10等10株产耐热木聚糖酶的菌株。其中,M2菌株可同时分泌木聚糖酶(Xyn)和纤维素酶(CMC和FPA)等,且木聚糖酶活最高(34.58 U/m L);经形态学、ITS序列同源性和系统进化树等分析确定其为嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus);现该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(编号为CGMCC NO.11334);*** CGMCC11334在45 oC条件下发酵8 d后Xyn最大达到39.07 U/mL。(2)利用SPSS进行主成分分析,构建了催化水解玉米芯的综合水解能力指数(XCHI);然后以XCHI为自变量,水解玉米芯的还原糖得率为因变量进行回归分析,回归分析模型证明了综合水解能力XCHI与糖得率之间存在相关关系,以XCHI为响应值,正交实验优化得到*** CGMCC11334产Xyn水解玉米芯能力的最适培养基组成为:麸皮16 g/L、微晶纤维素7 g/L、牛肉浸膏4 g/L、玉米浆3 g/L、小麦蛋白胨4 g/L、KHPO 1.0 g/L、MgSO4 2.0 g/L、CuSO4 0.15 g/L、FeSO4 0.05 g/L、VB1 0.15 g/L;在此条件下,Xyn、CMC和FPA的活性分别为135.12 U/mL、1.95 U/mL和1.68 U/m L,XCHI为1649.44。(3)采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow层析和Sephadex G-75等对Xyn纯化,其回收率为36.5%,纯化倍数为5.27;SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS确定了其分子质量为31.0 kDa,并预测了其结构特征。纯化的Xyn的酶学性质结果表明,其最适反应温度和最适反应pH分别为75 oC和5.0;Xyn具有良好的热稳定性和酸碱稳定性,在300oC和pH 2.00.0条件下残留酶活分别为80%和70%以上。Mg)和Ag+促进Xyn相对酶活至120.0%和119.6%;而Co、Cu和Mn抑制Xyn相对酶活至48.3%、96.5%和20.7%。Xyn的Km值为4.81 mg/mL,V为476.2 mg/(min·mL)。Xyn水解产物主要为木二糖,据水解产物和空间构型可初步判断该酶为第10家族的内切木聚糖酶。

关键词：嗜热子囊菌耐热木聚糖酶培养条件优化分离纯化酶学性质

一株嗜热子囊菌产生的碱性耐热过氧化氢酶及其应用潜力

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生物工程学报 2004年第3期20卷 423-428页

作者：方芳李寅堵国成张娟陈坚江南大学工业生物技术教育部重点实验室江南大学生物工程学院环境生物技术研究室无锡214036

研究了一株嗜热子囊菌产过氧化氢酶的摇瓶发酵条件 ,并对其在纺织工业中的应用潜力进行了评价。以2 0g L糊精和 1% (V V)乙醇为混合碳源时 ,过氧化氢酶酶活达到 15 94u mL ,比以糊精和乙醇单独为碳源时过氧化氢酶的活力之和还高 2 3%。... 详细信息

研究了一株嗜热子囊菌产过氧化氢酶的摇瓶发酵条件 ,并对其在纺织工业中的应用潜力进行了评价。以2 0g L糊精和 1% (V V)乙醇为混合碳源时 ,过氧化氢酶酶活达到 15 94u mL ,比以糊精和乙醇单独为碳源时过氧化氢酶的活力之和还高 2 3%。改变培养基的初始pH、提高发酵液中的溶氧水平及添加外源过氧化氢 ,过氧化氢酶的产量进一步提高到 2 76 2u mL ,比优化前提高了 5 8倍。将嗜热子囊菌的过氧化氢酶同来源于牛肝、黑曲霉的过氧化氢酶进行了热 (70℃ ,80℃ ,90℃ )、碱 (pH 9 0 ,pH 10 0 ,pH 11 0 )稳定性的比较。结果显示 ,产自嗜热子囊菌的过氧化氢酶对高温和强碱性的耐受性能明显优于其它来源的酶 ,在纺织染整工艺中具有良好的应用潜力。

关键词：过氧化氢酶嗜热子囊菌混合碳源过氧化氢热、碱稳定性

高产木聚糖酶嗜热子囊菌固体发酵条件与酶学性质

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食品工业科技 2012年第3期33卷 170-173,236页

作者：庞宗文郭法谋徐勇梁静娟彭幸陆薇广西大学生命科学与技术学院广西南宁530005

以本实验室从土壤中分离筛选到的一株高产木聚糖酶的嗜热子囊菌QS7-2-4为生产菌种,进行固体发酵产木聚糖酶的发酵条件研究,结果表明最佳产酶条件为:玉米芯:麸皮为7:3(w/w);最佳氮源为酵母膏和胰蛋白胨的混合氮源,添加量为1.5%;吐温-80... 详细信息

以本实验室从土壤中分离筛选到的一株高产木聚糖酶的嗜热子囊菌QS7-2-4为生产菌种,进行固体发酵产木聚糖酶的发酵条件研究,结果表明最佳产酶条件为:玉米芯:麸皮为7:3(w/w);最佳氮源为酵母膏和胰蛋白胨的混合氮源,添加量为1.5%;吐温-80添加量为0.5%,初始pH为7.2,培养基含水量为80%,250mL三角瓶装料量为8g,发酵温度50℃,发酵时间72h,该条件下木聚糖酶产量达27952U/g干基。该酶最适反应温度为75℃,最适反应pH为4.5,在70℃以下具有良好的稳定性,在室温下储藏150d仍然保留87%的活性。

关键词：木聚糖酶固体发酵嗜热子囊菌

混合添加乙醇和H_2O_2对嗜热子囊菌产过氧化氢酶的影响

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工业微生物 2009年第1期39卷 42-47页

作者：芦国军华兆哲堵国成陈坚江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

在以嗜热子囊菌(*** WSH03-01BC)生产过氧化氢酶的7L罐发酵研究中,发现混合添加适量的乙醇(75%)和H_2O_2可以促进菌体产酶。在发酵36h和48h分别添加0.8%(v/v)的乙醇时,酶活比对照提高了34.3%;当添加乙醇的总量超过2.4%时,对菌体的生长... 详细信息

在以嗜热子囊菌(*** WSH03-01BC)生产过氧化氢酶的7L罐发酵研究中,发现混合添加适量的乙醇(75%)和H_2O_2可以促进菌体产酶。在发酵36h和48h分别添加0.8%(v/v)的乙醇时,酶活比对照提高了34.3%;当添加乙醇的总量超过2.4%时,对菌体的生长及产酶有明显的抑制作用;在发酵36～60h恒速流加1.6%的乙醇,CAT的酶活达到2519U/mL,单位细胞产酶能力提高了47.3%;在发酵36h～60h恒速流加1.6%的乙醇并在48h混合添加0.4%的H_2O_2时,CAT的酶活达到2786U/mL,比对照提高了50.1%。

关键词：过氧化氢酶嗜热子囊菌乙醇过氧化氢混合添加

疏绵状嗜热丝孢菌和嗜热子囊菌光孢变种MnSOD基因的克隆及转基因研究

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疏绵状嗜热丝孢菌和嗜热子囊菌光孢变种MnSOD基因的克隆及转基因...

作者：张超山东农业大学

学位级别：硕士

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)能够催化超氧阴离子(O2·-)发生歧化反应,在生物体防御氧化损伤的过程中,发挥着重要作用。超氧化物歧化酶已在食品、医药、化妆品和农业等领域中得到了广泛的应用,具有重要商业价值。盐胁迫... 详细信息

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)能够催化超氧阴离子(O2·-)发生歧化反应,在生物体防御氧化损伤的过程中,发挥着重要作用。超氧化物歧化酶已在食品、医药、化妆品和农业等领域中得到了广泛的应用,具有重要商业价值。盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一,是影响植物生长发育的主要因素。当植物遭受包括高盐、干旱、低温和高温等环境胁迫时可产生大量活性氧。活性氧进而破坏细胞内的大分子,从而使DNA裂解,造成膜的损伤或影响蛋白质的合成及稳定性等。利用基因工程技术提高植物耐盐性是解决这一问题的最有效途径之一。疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)和嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)是广泛分布的,生长上限温度较高的嗜热真菌,从这二种真菌中已分离了多种嗜热酶,具有较高的研究和应用价值。本实验室通过RT-PCR从疏绵状嗜热丝孢菌和嗜热子囊菌光孢变种中已经分别分离到了一个MnSOD酶基因,命名为zjmnsod和esjmnsod。序列分析表明zjmnsod基因全长cDNA序列为791bp,包括654bp的ORF,编码217个氨基酸。该基因已在GenBank中注册,登录号为EU364837。esjmnsod基因全长cDNA为878bp,包含一个由231个氨基酸组成的开放阅读框。该基因已在GenBank中注册,登录号为EF428323。为了验证盐胁迫下疏绵状嗜热丝孢菌zjmnsod和嗜热子囊菌光孢变种esjmnsod基因的功能,将zjmnsod及esjmnsod基因分别构建到35s启动子驱动的植物表达载体pROKⅡ中,通过农杆菌介导法转化烟草。经PCR和RT-PCR检测表明疏绵状嗜热丝孢菌zjmnsod和嗜热子囊菌光孢变种esjmnsod基因分别整合到烟草基因组中。通过高盐胁迫下的分析转嗜热真菌sod基因提高了烟草在种子萌发及小苗生长阶段的耐盐性。两种转基因植株对烟草赤星病有一定的抵抗能力,且转zjmnsod基因比转esjmnsod基因烟草的抗病能力更强。为了验证盐胁迫下疏绵状嗜热丝孢菌zjmnsod和嗜热子囊菌光孢变种esjmnsod基因在水稻种的耐盐性,本研究将zjmnsod及esjmnsod基因分别构建到Maize Ubiquitin启动子驱动的植物表达载体pU1301中,通过农杆菌介导法转化水稻,为通过水稻转基因提高水稻的抗性和产量提供科学的依据。

关键词：嗜热丝孢菌嗜热子囊菌热稳定超氧化物歧化酶基因克隆转基因