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鱼类铁调素生物学功能与体外表达的研究进展

水产科学 2023年第5期42卷 901-910页

作者：颜研李旭东裴超孔祥会河南师范大学水产学院河南新乡453007 河南省水产技术推广站河南郑州450008

近年来,细菌性疾病频发,抗生素不规范使用导致细菌耐药性问题日益严重^([1])。研发新的抗菌药物,替代抗生素是解决细菌耐药性问题的一个方向。抗菌肽是具有抗菌作用的小分子多肽,相比于抗生素,不易产生耐药性,可作为抗生素耐药细菌治疗... 详细信息

近年来,细菌性疾病频发,抗生素不规范使用导致细菌耐药性问题日益严重^([1])。研发新的抗菌药物,替代抗生素是解决细菌耐药性问题的一个方向。抗菌肽是具有抗菌作用的小分子多肽,相比于抗生素,不易产生耐药性,可作为抗生素耐药细菌治疗的潜在药物^([2-3])。其中鱼类铁调素(Hepcidin)具有广谱的抗菌活性,抗菌效果明显,已成为当前抗菌肽研究的热点。

关键词：鱼类铁调素抗菌肽生物学功能体外表达

人血小板膜糖蛋白ITGB3基因终止突变C．1476G〉A的体外表达研究

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中华医学遗传学杂志 2016年第1期33卷 17-21页

作者：刘瑛许先国陈舒洪小珍陶苏丹何吉朱发明吕杭军浙江省血液中心输血研究所、卫生部血液安全研究重点实验室浙江省血液安全研究重点实验室杭州310006

目的对ITGB3基因新的终止突变c．1476G〉A进行体外表达研究，以阐明其功能。方法应用体外定点诱变技术构建突变型ITGB3e．1476G〉AcDNA的真核表达载体，转化感受态细胞，提取质粒后测序验证。采用非脂质体介导重组质粒转染中国仓鼠卵巢... 详细信息

目的对ITGB3基因新的终止突变c．1476G〉A进行体外表达研究，以阐明其功能。方法应用体外定点诱变技术构建突变型ITGB3e．1476G〉AcDNA的真核表达载体，转化感受态细胞，提取质粒后测序验证。采用非脂质体介导重组质粒转染中国仓鼠卵巢癌细胞株（Chinesehamsterovariancancer，CHO）细胞，经G418筛选获取稳定表达细胞株。采用实时荧光定量PCR、Western印迹和流式细胞术分别检测CHO稳定表达株ITGB3基因的mRNA表达和血小板膜糖蛋白llIa（glycoproteinIIIa，GPⅢa）糖蛋白水平。结果成功构建野生型和突变型ITGB3cDNA的真核表达载体，转染筛选后分别获得了稳定表达的CHO细胞株。突变型细胞株中CD61抗原表达量仅为野生型的37％，而ITGB3mRNA转录水平为野生型的6％。Western印迹结果显示，野生型细胞株稳定表达完整的GPⅢa蛋白，而突变型CHO细胞株无完整的GPⅢa蛋白表达。结论ITGB3c．1476G〉A终止突变可导致ITGB3基因的转录水平降低，影响GPⅢa蛋白合成及CD61抗原的表达水平。

关键词： ITGB3基因血小板膜糖蛋白HIa 终止突变体外表达

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岗梅磺酸基转移酶基因的克隆与体外表达

中草药 2019年第11期50卷 2683-2689页

作者：林青小芸官慧儿纪晓宇徐晖广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心岭南中药资源教育部重点实验室(广州中医药大学)国家中成药工程技术研究中心南药研发实验室

目的药用植物岗梅Ilex asprella含有多种活性磺化三萜类成分,克隆岗梅中的磺酸基转移酶编码(sulfotransferase,ST)基因,以了解其独特的磺化机制。方法利用RT-PCR技术,由岗梅叶片RNA扩增获得了2个可能的磺酸基转移酶基因IaST1和IaST2,利... 详细信息

目的药用植物岗梅Ilex asprella含有多种活性磺化三萜类成分,克隆岗梅中的磺酸基转移酶编码(sulfotransferase,ST)基因,以了解其独特的磺化机制。方法利用RT-PCR技术,由岗梅叶片RNA扩增获得了2个可能的磺酸基转移酶基因IaST1和IaST2,利用生物信息学工具对其进行分析,并将其转化至大肠杆菌E. coli进行原核表达。结果序列分析显示,IaST1与IaST2各包含1个开放阅读框,分别长1002bp和993bp,编码333和330个氨基酸,理论相对分子质量为55500和54700。二者均具有ST的5个保守结构氨基酸序列,与黄顶菊Flaveriabidentis的黄酮醇C-3磺酸基转移酶亲缘关系较近。SDS-PAGE显示在E. coli中成功表达了IaST1和IaST2蛋白。结论首次从岗梅中克隆了ST基因,为后续阐明其功能及其在岗梅三萜磺化中的作用奠定了基础。

关键词：岗梅磺酸基转移酶基因序列分析基因克隆体外表达

海洋生物黏附蛋白体外表达、纯化与检测技术研究进展

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浙江海洋大学学报（自然科学版） 2023年第1期42卷 69-81页

作者：张颖李世国朱佳兰战爱斌中国科学院生态环境研究中心北京100085 中国科学院大学资源与环境学院北京100049

天然海洋生物黏附蛋白分泌量极少、直接提取受到技术限制,难以满足日益增长的市场需求。借助于基因工程手段,近些年发展起来的海洋生物黏附蛋白体外表达、纯化和检测技术为上述难题提供了解决思路,由此制备的具有生物活性的黏附蛋白在... 详细信息

天然海洋生物黏附蛋白分泌量极少、直接提取受到技术限制,难以满足日益增长的市场需求。借助于基因工程手段,近些年发展起来的海洋生物黏附蛋白体外表达、纯化和检测技术为上述难题提供了解决思路,由此制备的具有生物活性的黏附蛋白在实际应用过程中表现出色。本文全面综述了海洋生物黏附蛋白体外制备的研究进展,主要集中在蛋白表达系统、蛋白纯化体系和蛋白检测技术等方面。同时,基于现有进展对未来相关技术的发展趋势也进行了展望,以期推动海洋生物黏附蛋白研究和应用工作广泛开展,为解决海洋生态环境问题、促进海洋生物来源的仿生材料研发提供技术支撑。

关键词：海洋生物黏附蛋白体外表达蛋白纯化生物污损仿生

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慢病毒介导EGFP在小鼠胚胎的体外表达

沈阳农业大学学报 2016年第5期47卷 559-566页

作者：许诺贾俊龙王维朱玉博王雪晗白文林罗光彬沈阳农业大学畜牧兽医学院沈阳110161

为探讨3种感染方法对不同发育阶段胚胎中EGFP基因表达影响,利用透明带下注射法、胞质内注射法及透明带切口与慢病毒共培养法感染1-细胞期小鼠胚胎,分别提取以上3种方法感染慢病毒的不同发育阶段胚胎的EGPF基因,并以其为模板,扩增出630bp... 详细信息

为探讨3种感染方法对不同发育阶段胚胎中EGFP基因表达影响,利用透明带下注射法、胞质内注射法及透明带切口与慢病毒共培养法感染1-细胞期小鼠胚胎,分别提取以上3种方法感染慢病毒的不同发育阶段胚胎的EGPF基因,并以其为模板,扩增出630bp的EGPF基因片段。结果表明:慢病毒转染后在不同发育阶段的胚胎中,均扩增出EGFP目的片段(630bp)。当透明带下注射病毒时,90p L注射组(C组)和60p L注射组(B组)的EGFP基因阳性率显著优于30p L注射组(A组)(p0.05)。透明带做切口的胚胎与含不同浓度慢病毒共培养时,从1-细胞期到4-细胞期胚胎为止组间差异不显著(p>0.05),而胚胎发育的后期2×103cfu·μL^(-1)组和3×103cfu·μL^(-1)组均极显著优于1×103cfu·μL^(-1)组(p0.05)。透明带下注射慢病毒与胞质内注射慢病毒时,注射90p L(病毒滴度3×103cfu·μL^(-1))组的EGFP基因体外表达效果最好;透明带做切口的胚胎与含不同浓度慢病毒共培养时,在3×103cfu·μL^(-1)滴度培养液中培养的EGFP基因体外表达效果最好。

关键词：慢病毒胚胎 EGFP 体外表达

三个灰飞虱P450酶的体外表达和对吡虫啉的代谢研究

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三个灰飞虱P450酶的体外表达和对吡虫啉的代谢研究

作者：朱琳南京农业大学

学位级别：硕士

灰飞虱Laodelphax striatellus（Fallén）是我国重要的禾谷类害虫。施用化学药剂是防治灰飞虱的主要措施,随着杀虫剂的大量施用,灰飞虱对吡虫啉和毒死蜱等多种常用杀虫剂产生了抗药性。研究表明,细胞色素P450酶活性的增强是灰飞虱对吡... 详细信息

灰飞虱Laodelphax striatellus（Fallén）是我国重要的禾谷类害虫。施用化学药剂是防治灰飞虱的主要措施,随着杀虫剂的大量施用,灰飞虱对吡虫啉和毒死蜱等多种常用杀虫剂产生了抗药性。研究表明,细胞色素P450酶活性的增强是灰飞虱对吡虫啉产生抗性的主要原因。实验室前期已证实,抗吡虫啉灰飞虱Imid品系中过量表达的CYP6AY3v2和CYP353D1v2对吡虫啉具有代谢作用。由于细胞色素P450酶具有进化的可塑性,所以,灰飞虱中可能还有其他的P450酶对吡虫啉具有代谢作用。为了鉴定这些潜在的P450酶,本研究前期利用转基因技术,从63个灰飞虱P450基因中筛选到CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10这三个可能对吡虫啉具有代谢作用的P450酶。为了验证筛选结果,本研究对CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10三个P450酶进行了体外表达、酶活力测定和对吡虫啉的体外代谢研究,研究结果总结如下:1.3个灰飞虱重组P450酶的体外表达利用昆虫杆状病毒表达系统,对灰飞虱P450酶CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10以及细胞色素P450还原酶（CPR）进行了体外重组表达。利用空斑分析法测得空载FastBac-HTA、CPR以及三个灰飞虱重组P450酶的P3代病毒滴度分别为 7.0×107（pfu/mL）、6.0×107（pfu/mL）、4.0×107（pfu/mL）和 5.0×107（pfu/mL）。将三个重组P450酶的P3代病毒液分别与CPR按MOI（病毒感染复数）值分别为2和0.2加入High Five细胞悬液中,进行体外表达。利用CO差光谱法分别测定了重组CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10的蛋白含量及光谱特征。结果显示,这三个重组P450酶与CO结合后在450 nm处都有明显的吸收峰,表明三个重组P450蛋白性质稳定并具备P450蛋白的特征;其次,CYP6CW1、CYP6FK1 和 CYP380C10 的蛋白含量分别为 284.25±4.12 pmol/mg protein、138.42±4.64 pmol/mg protein 和 311.09±1.89 pmol/mg protein。2.3个灰飞虱重组P450酶对四种模式底物代谢活性的测定分别测定了灰飞虱三个重组P450酶CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10蛋白对对硝基苯甲醚（PNA）、7-乙氧基香豆素（EC）、7-苄基-4-三氟甲基香豆素（BFC）和7-甲基试卤灵（MR）四种模式底物的代谢活性。结果显示:与对照组相比,CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10均对EC有较高的氧脱乙基活性,比活力值在2.16～3.56之间;CYP6CW1和CYP6FK1对PNA显示出了较高的氧脱甲基活性,比活力值分别是3.36和2.59;在以MR为底物时,仅CYP6CW1显示出了氧脱甲基活性,活性比值为2.23;三个重组P450酶对BFC都没有氧脱苄基活性;上述结果表明三个重组表达的P450酶对不同的底物显示不同的活性。3.3个灰飞虱重组P450酶对吡虫啉的体外代谢研究将重组P450酶CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10分别与吡虫啉进行孵育,以未加入NADPH再生系统的样品和空载HTA加上NADPH为阴性对照,通过超高效液相-串联四级杆飞行时间质谱UPLC-QTOF MS检测代谢产物5’-羟基吡虫啉的生成量,并以5’-羟基吡虫啉的生成速率表征重组P450酶对吡虫啉的代谢活性。结果显示:重组表达的CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10生成5’-羟基吡虫啉的速率分别是 0.0198±0.0008 pmol 产物/min/pmol P450,0.0172±0.0005 pmol 产物/min/pmol P450 和 0.0055±0.0001 pmol 产物/min/pmol P450。进一步的酶动力学研究结果显示:重组表达的CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10代谢吡虫啉时,代谢产物5’-羟基吡虫啉的生成具有时间依赖性;并且测得了CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10的动力学参数Km值分别为79.86±6.5 μM、58.69±2.6 μM和67.15±3.2 μM,进一步得到P450酶代谢吡虫啉的内在清除率（Vmax/Km）分别为 0.00025、0.00029 和 0.00008。综上所述,本文研究结果证实了灰飞虱重组P450酶CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10对吡虫啉代谢的作用,为灰飞虱CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10可能参与吡虫啉代谢抗性的形成提供了证据。

关键词：灰飞虱 P450基因 Bac-to-Bac表达系统体外表达体外代谢

KISS-1基因对结肠癌细胞株HT29体外表达的影响

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中华实验外科杂志 2015年第11期32卷 2708-2711页

作者：刘虹孔刚龚志军卿笃桔李恩就黎飞广东省江门市中心医院胃肠外科 529000

目的观察KISS-1基因对结肠癌细胞株HT29体外表达的作用和对其生物学功能的影响.方法通过基因转染法使KISS-1在结肠癌细胞株HT29中稳定表达,应用噻唑蓝（MTT）法和Transwell侵袭实验检测KISS-1表达对结肠癌细胞株HT29的增殖和侵袭能力... 详细信息

目的观察KISS-1基因对结肠癌细胞株HT29体外表达的作用和对其生物学功能的影响.方法通过基因转染法使KISS-1在结肠癌细胞株HT29中稳定表达,应用噻唑蓝（MTT）法和Transwell侵袭实验检测KISS-1表达对结肠癌细胞株HT29的增殖和侵袭能力的作用和影响;通过免疫组织化学法和实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）技术检测KISS-1基因mRNA在体外结肠癌细胞株HT29中的表达水平,并用Real-time PCR测定转染后结肠癌细胞株HT29中c-fos、c-jun mRNA水平表达变化,并通过显微镜、透射电镜等观察凋亡细胞的形态学改变.结果（1）Real-time PCR和免疫细胞组织化学证实转染后结肠癌细胞中有KISS-1稳定表达.（2）MTt法表明：培养0、24 h时各组HT29细胞数差异无统计学意义（P＞0.05）,48 h后,随着培养时间延长,转染组HT29细胞数明显低于空白对照组与阴性对照组（P＜0.05）,而空白对照组与阴性对照组HT29细胞数差异无统计学意义（P＞0.05）.（3） Transwell侵袭实验结果：转染KISS-1基因的结肠癌细胞HT29穿透Matrigel基底膜的细胞数显著低于空质粒转染组及空白对照组细胞（P＜0.01）,侵袭指数显著降低（P＜0.01）,侵袭力抑制率达到56.5％,显著低于空质粒转染组及空白对照组细胞（P＜0.01）.空质粒转染组及空白对照组细胞比较,侵袭穿膜细胞数差异无统计学意义（P＞0.05）.（4）KISS-1作用于结肠癌细胞株HT29 24 h后,形态学观察结肠癌细胞株HT29发生凋亡或坏死.（5）Real-time PCR：转染组c-jun和c-fos吸光度值为0.87 ±0.16和0.44±0.12,阴性对照组吸光度值为1.82±0.39和1.76±0.34,空白对照组吸光度值为1.65±0.36和1.58±0.31.与对照组比较,转染组c-jun和c-fos扩增产物条带吸光度值均显著降低（P＜0.01）.结论 KISS-1基因对体外结肠癌细胞株HT29具有抑制增殖和促进凋亡作用,其可能是通过负性调控信号通路降低结肠癌细胞中c-fos、c-jun的表达.

关键词：结肠癌细胞 KISS-1基因体外表达

甘蓝抽薹开花抑制因子FLC与SVP体外表达及相互作用

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植物生理学报 2013年第9期49卷 935-942页

作者：杨朴丽张丹华刘智宇许俊强王志敏汤青林宋明西南大学园艺园林学院南方山地园艺学教育部重点实验室重庆市蔬菜学重点实验室重庆400715

甘蓝抽薹开花抑制因子FLC与SVP可能存在相互作用,从而调节开花时间。为进一步的验证该相互作用,以甘蓝‘ZQ’为材料,扩增了594 bp的FLC cDNA和726 bp的SVP cDNA序列,它们分别编码197和241个氨基酸,且均属MIKC型蛋白。NCBI比对发现FLC与B... 详细信息

甘蓝抽薹开花抑制因子FLC与SVP可能存在相互作用,从而调节开花时间。为进一步的验证该相互作用,以甘蓝‘ZQ’为材料,扩增了594 bp的FLC cDNA和726 bp的SVP cDNA序列,它们分别编码197和241个氨基酸,且均属MIKC型蛋白。NCBI比对发现FLC与BoFLC3同源性高达98%,SVP与BoSVP-a同源性高达99%。将甘蓝FLC和SVP分别与原核表达载体pET43.1a融合,构建重组质粒pET43.1a-FLC、pET43.1a-SVP,并转化宿主菌大肠杆菌BL21,均能够在体外表达目的蛋白。利用免疫共沉淀的原理及pET43.1a-FLC、pET43.1a-SVP融合蛋白序列中的6×His标签能与Ni+结合的特点,结合SDSPAGE,检测到体外表达蛋白FLC与SVP能相互作用并形成复合体,这为深入研究FLC与SVP互作机理及探讨其与抽薹开花因子的相互作用提供了理论依据和技术基础。

关键词：甘蓝 FLC SVP 体外表达蛋白质相互作用

PTC124对PAH无义突变蛋白体外表达的矫正作用

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PTC124对PAH无义突变蛋白体外表达的矫正作用

作者：多磊内蒙古大学

学位级别：硕士

苯丙酮尿症(Phenylketonuria,PKU)是一类由于体内苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe)代谢异常而导致的疾病,呈常染色体隐性遗传。PKU在世界范围内分布广泛、发病率高,会严重影响患者的认知和心理。目前PKU患者主要通过饮食疗法控制病情,这种... 详细信息

苯丙酮尿症(Phenylketonuria,PKU)是一类由于体内苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe)代谢异常而导致的疾病,呈常染色体隐性遗传。PKU在世界范围内分布广泛、发病率高,会严重影响患者的认知和心理。目前PKU患者主要通过饮食疗法控制病情,这种方式不仅降低了患者的生活质量,也给社会带来极大的经济负担。因此,临床上需要新的治疗方法。部分PKU患者的病因来自苯丙氨酸羟化酶(Phenylalanine hydroxylase,PAH)的无义突变,这种突变类型在某些实验中可以被新型化合物PTC124矫正。本实验通过构建相关载体,对转染无义突变PAH基因的细胞进行PTC124处理并检测其在转录和翻译水平上的变化,探索了PTC124对PAH无义突变类型PAH和PAH在表达过程中的矫正效果,以期为PKU的治疗提供新策略。1、构建相关载体本实验利用基因工程技术,成功构建6个真核表达载体。一类是带有红荧光标记的pCMV-DsRed-PAH、pCMV-DsRed-PAH和pCMV-DsRed-PAH,另一类是带有G418标记的pcDNA3.1-PAH、pcDNA3.1-PAH和pcDNA3.1-PAH。2、体外表达系统的确定通过查阅文献选择HEK293细胞实现载体基因的表达。购买细胞株后通过常规的细胞培养技术对细胞进行扩培,并对其mRNA进行初步分析,未检测出PAH基因的表达,证明HEK293细胞符合实验要求。3、载体的转染及细胞筛选本实验采用脂质体转染的方式将载体基因分别导入HEK293细胞。对转染了pCMV-DsRed-PAH、pCMV-DsRed-PAH和pCMV-DsRed-PAH的细胞进行流式细胞仪检测,转染效率达到72%。对转染了pcDNA3.1-PAH、pcDNA3.1-PAH和pcDNA3.1-PAH的细胞进行G418筛选,存活细胞即为阳性细胞。4、PTC124浓度的确定分别用浓度为0μM、50μM、100μM和200μM的PTC124处理HEK293细胞,再对其进行细胞活力、细胞周期、细胞凋亡和细胞增殖分析。发现浓度为50μM和100μM的PTC124对细胞是相对安全的,浓度为200μM的PTC124对细胞活性和细胞增殖都有消极影响,还会将细胞阻滞在S期,同时促进细胞凋亡。最后选择100μM为后续实验中PTC124的处理浓度。5、各实验组的检测使用载体pCMV-DsRed-PAH、pCMV-DsRed-PAH、pCMV-DsRed-PAH、pcDNA3.1-PAH、pcDNA3.1-PAH和pcDNA3.1-PAH分别对HEK293细胞进行脂质体转染,然后将其分成两部分:对照组是转染PAH基因的细胞,进行正常的细胞培养;实验组是转染了无义突变PAH基因的细胞,一部分进行普通培养,另一部分用浓度为100μM的PTC124处理。48h后分别对上述细胞进行qPCR和Western Blot检测。qPCR实验表明,各实验组均表达了PAH。PAH无义突变基因的表达量经矫正培养后明显高于普通培养,但仍低于转染PAH基因的表达量。Western Blot实验表明,各实验组都成功表达了PAH蛋白。经矫正培养后无义突变实验组产生的PAH增多。利用酶活性实验检测野生型和无义突变PAH的活性。分别利用pcDNA3.1-PAH、pcDNA3.1-PAH和pcDNA3.1-PAH载体转染细胞,转染了PAH基因的细胞正常培养,作为阳性参照。转染了PAH无义突变基因的细胞分别经过普通培养和矫正培养。实验发现,转染野生型PAH基因的细胞合成了有活性的PAH;转染了pcDNA3.1-PAH和pcDNA3.1-PAH的细胞中,经过普通培养的未检测到活性PAH,经过PTC124矫正后细胞合成了有活性的PAH;与转染野生型PAH基因的细胞相比,转染载体pcDNA3.1-PAH的活性达到了19%,转染载体pcDNA3.1-PAH的活性达到了13%。综上所述,PTC124在PAH突变基因PAH和XPAH的表达过程中可以发挥矫正作用,使之能够合成有活性的PAH蛋白。

关键词：苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶 PTC124 体外表达