检索结果-南通市图书馆

作者：徐辉扬州大学

学位级别：硕士

伏马毒素(Fumonisins)是由串珠镰刀菌产生的一类双酯型代谢产物,目前已经发现的伏马毒素有28种,其主要成分是伏马毒素b1 (Fb1)。Fb1主要存在于粮食作物和饲料中,具有神经毒性、肝肾毒性和肺毒性等,还可诱发癌症,对人类和动物的健康构成... 详细信息

伏马毒素(Fumonisins)是由串珠镰刀菌产生的一类双酯型代谢产物,目前已经发现的伏马毒素有28种,其主要成分是伏马毒素b1 (Fb1)。Fb1主要存在于粮食作物和饲料中,具有神经毒性、肝肾毒性和肺毒性等,还可诱发癌症,对人类和动物的健康构成严重的威胁。目前常用于检测Fb1的检测方法有多种,包括薄层析色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等,但这些方法都具有需要特殊的仪器,耗时较长,且需要专业人员操作等不足。因此,建立针对Fb1快速、简便、灵敏的检测方法具有重要的现实意义。本试验利用单克隆抗体制备及酶联免疫吸附技术,建立了检测Fb1含量的ELISA检测方法。该方法具有操作简单,成本低,特异性强等特点,适合大批量样品的快速检测。***1人工抗原的合成与鉴定。根据伏马毒素b1分子结构特点,使用戊二醛一步法将Fb1分别与bSA和OVA偶联,合成免疫抗原Fb1-bSA与检测抗原Fb1-OVA。通过紫外扫描、SDS-PAGE及免疫学方法初步判断Fb1与载体蛋白偶联成功。利用bCA法测得Fb1-bSA和Fb1-OVA的蛋白浓度分别为0.70mg/mL,1.83mg/mL。***1单克隆抗体的制备。将免疫抗原Fb1-bSA常规免疫6-8周龄雌性bALb/c小鼠。五免之后一周断尾采血检测抗体效价在1：10,000以上。加强免疫3d后取免疫小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。利用HAT选择性培养基及酶联免疫吸附技术筛选出阳性杂交瘤细胞。采用有限稀释法进行亚克隆,最后筛选出2株能稳定分泌抗Fb1单克隆抗体杂交瘤细胞。5F5和2C6所制腹水效价均达到1：256,000,腹水蛋白浓度分别为10.79mg/mL和12.21mg/mL。3. ELISA检测方法的建立。选取5F5杂交瘤细胞注射小鼠腹腔,制备小鼠腹水,建立检测Fb1间接竞争ELISA法。利用方阵法确定包被抗原最佳工作浓度为1：2,000,腹水最佳工作浓度1：8,000。制备Fb1药物抑制标准曲线,线性方程为y=0.1648x+0.3706(R2=0.9845),半数抑制浓度(IC5o)为6.1 ng/mL, LOD低于0.05ng/mL。交叉试验结果显示,制备的单克隆抗体对Fb1抑制率100%,与呕吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、黄曲霉毒素b1(AFb1)、α-玉米赤霉烯醇(α-ZON)等基本无交叉反应。4.回收试验。利用建立的间接竞争ELISA法对饲料玉米进行了Fb1添加回收试验。对玉米样品中Fb1进行模拟提取,当提取液作8倍以上稀释处理时,基质干扰基本消失,在0.05-500ng/mL范围内标准曲线方程为y=0.1381x+0.4225(R2=0.9822)。在玉米中添加5,50,200,500 nng/mL 4个浓度Fb1标准品做添加回收率,结果回收率在84.2%-102.6%之间,变异系数在2.48%～8.79%。

关键词：伏马毒素b1 单克隆抗体完全抗原间接竞争ELISA

伏马毒素b1在猪卵母细胞成熟过程中的毒性作用

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伏马毒素B1在猪卵母细胞成熟过程中的毒性作用

作者：曹伟南京农业大学

学位级别：硕士

伏马毒素(Fumonisins)是由串珠镰刀菌和再育镰刀菌等真菌产生,其包含多种毒素及其衍生物,广泛分布于世界各地的粮食作物中,主要污染玉米和玉米制品,是目前谷物污染的主要霉菌毒素之一。在已知的众多伏马毒素衍生物中,b系列检出率最高,其... 详细信息

伏马毒素(Fumonisins)是由串珠镰刀菌和再育镰刀菌等真菌产生,其包含多种毒素及其衍生物,广泛分布于世界各地的粮食作物中,主要污染玉米和玉米制品,是目前谷物污染的主要霉菌毒素之一。在已知的众多伏马毒素衍生物中,b系列检出率最高,其中,伏马毒素b1(Fb1)性质稳定,在畜禽的各种产品中均能检测到其存在,且分布广毒性大。现已发现,动物摄取经Fb1污染的食物后,会产生明显的肝肾毒性、神经毒性、免疫毒性、致癌性等毒性效应。但Fb1是否会对动物生殖细胞也产生毒性作用、造成何种损伤目前尚不明确。本研究以体外成熟的猪卵母细胞为研究对象,探究Fb1对猪卵母细胞成熟的影响,并通过间接免疫荧光结合共聚焦成像技术分析Fb1对卵母细胞减数分裂进程中细胞超微骨架的影响,在此基础之上,进一步从细胞氧化还原状态以及氧化应激相关基因的表达水平进行研究,分析Fb1对卵母细胞的毒性作用是否与细胞氧化损伤相关,以期为临床上有效防治Fb1所致的生殖毒性损伤提供重要的实验参考。主要研究内容及结果如下:一、伏马毒素b1对猪卵母细胞体外成熟的影响本试验旨在研究伏马毒素b1(Fb1)对猪卵母细胞体外成熟的影响,探讨Fb1是否会对猪卵母细胞产生毒性损伤。将猪卵母细胞置于含有不同浓度Fb1的培养液中,体外成熟培养至44h,镜下观察卵丘扩散及第一极体排出情况;通过间接免疫荧光结合共聚焦成像技术分析Fb1对卵母细胞减数分裂进程及细胞超微骨架的影响。结果显示,Fb1处理后COCs卵丘扩散受到明显抑制,且第一极体排出率显著下降,并与Fb1作用浓度呈剂量依赖性;细胞周期检测结果表明Fb1处理后,停滞在GVbD期的卵母细胞比例显著上升,并伴随有明显的染色体排列紊乱与纺锤体组装异常,与对照组相比差异显著。本试验结果表明,伏马毒素b1可显著抑制猪卵母细胞体外成熟,并引起细胞染色体排列紊乱、纺锤体结构异常,最终导致卵母细胞减数分裂阻滞在GVbD期。二、伏马毒素b1对猪卵母细胞氧化应激的影响为进一步研究Fb1对猪卵母细胞的毒性作用,本试验从细胞氧化还原状态以及氧化应激相关基因的表达进行研究,分析Fb1对卵母细胞的毒性作用是否与细胞氧化应激相关。通过收集经Fb1处理后的猪卵母细胞,采用DCFH-DA法染色检测细胞ROS水平,Realtime-PCR检测氧化应激相关因子CAT、GSH-Px、SOD以及凋亡相关基因bcl-2、bax和Caspase-3的表达情况。结果显示,经Fb1处理后,猪卵母细胞ROS含量明显增加,氧化应激相关因子CAT、SOD1和SOD2的mRNA相对表达量也随之升高;进一步对凋亡相关基因检测发现,Fb1处理导致卵母细胞CASPASE-3和bAX的mRNA表达显著升高,而bCL-2 mRNA水平则显著下降。这些研究结果表明伏马毒素b1可诱导猪卵细胞产生氧化应激,并促进细胞凋亡,最终导致卵母细胞成熟失败。

关键词：猪卵母细胞伏马毒素b1 氧化应激凋亡

伏马毒素b1和葡萄球菌肠毒素A、b的免疫芯片技术研究

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伏马毒素B1和葡萄球菌肠毒素A、B的免疫芯片技术研究

作者：左小霞中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

免疫芯片是蛋白质芯片的一种，是指固定于支持介质上的蛋白质构成的微阵列。该技术与传统的检测方法相比，有着一定的优越性，因此，日益受到人们的青睐。该研究是以伏马毒素b、葡萄球菌肠毒素A、b为检测对象，建立了用于伏马毒素b、葡... 详细信息

免疫芯片是蛋白质芯片的一种，是指固定于支持介质上的蛋白质构成的微阵列。该技术与传统的检测方法相比，有着一定的优越性，因此，日益受到人们的青睐。该研究是以伏马毒素b、葡萄球菌肠毒素A、b为检测对象，建立了用于伏马毒素b、葡萄球菌肠毒素A、b检测的免疫芯片的技术方法。本研究先将抗原或抗体固定在醛基化玻片表面，利用经戊二醛等试剂处理过的表面带有醛基的玻璃片作为载体，通过载体表面的醛基与抗原或抗体的游离氨基的结合实现抗原或抗体的固定。在检测伏马毒素b时采用抗体竞争法。检测时将待测物伏马毒素b与一定量的Cy3标记的伏马毒素b—牛血清白蛋白同时加到玻片上。待测物伏马毒素b与标记的伏马毒素b—牛血清白蛋白竞争结合玻璃片上固定的抗体。由于标记物是定量的，当待测物浓度越高则结合上的伏马毒素b越多，而结合上的标记物就越少，从而荧光信号强度就越弱。反之，荧光信号就越强，从而实现了待测物的测定。最低检测浓度为1μg／ml的伏马毒素b。在检测葡萄球菌肠毒素A、b时采用双抗体夹心法。对影响免疫芯片检测结果的实验条件进行了优化，检测时将SEA、SEb加入反应池中，反应后清洗掉未结合的SE，再加入相应的标记抗体，形成固定抗体—待测物—标记抗体的夹心式结构。当待测物越多时，结合上的抗原就多，相应结合上的标记抗体也越多，产生的荧光信号也越强，荧光信号强度随待测物浓度的增加而增加，当浓度高于一定值时，荧光信号强度趋于一定值。按优化后的条件检测SEA、SEb，最低均可检测1ng／ml的样品。并实现了在同一张芯片上同时检测葡萄球菌肠毒素A、b，灵敏度较高。随着蛋白质芯片各项技术的进步与成熟，免疫芯片技术正成为食品安全快速检测中主要发展方向和非常重要的检测手段之一。可以预见这一高新技术将应用于更广的预域。

关键词：伏马毒素b1 葡萄球菌肠毒素A、b 免疫芯片

伏马毒素b1对猪血管内皮细胞自噬及其相关通路的研究

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伏马毒素B1对猪血管内皮细胞自噬及其相关通路的研究

作者：范颖湖南农业大学

学位级别：硕士

伏马毒素(Fumonisin,Fb)是目前农作物产品和动物饲料中广泛存在的主要真菌毒素之一,对养殖业的规模化发展、动物食品安全与人类健康造成了极大的威胁。伏马毒素b是伏马毒素中毒性最强的一种,与人和动物的多种疾病相关,如猪肺水肿、马脑... 详细信息

伏马毒素(Fumonisin,Fb)是目前农作物产品和动物饲料中广泛存在的主要真菌毒素之一,对养殖业的规模化发展、动物食品安全与人类健康造成了极大的威胁。伏马毒素b是伏马毒素中毒性最强的一种,与人和动物的多种疾病相关,如猪肺水肿、马脑白质软化症、人神经管型缺陷等,但其作用机制尚不清楚。本研究以体外培养猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)为研究对象,探索Fb对SUVEC细胞自噬及其相关通路的影响,为Fb致猪肺水肿的毒性作用机制提供理论基础。本研究通过体外培养SUVEC细胞,研究不同浓度的Fb对细胞自噬的影响。采用MTT法检测了不同浓度Fb作用不同时间对细胞存活率的影响,划痕实验观察细胞迁移能力,透射电镜观察细胞内自噬小体的产生,q PCR和Western blot技术检测细胞自噬及PI3K/AKT/mTOR和AMPK/mTOR通路中相关基因和蛋白的表达变化,构建p EGFP-N1-FLAG-LC3质粒并转染细胞检测LC3的聚集数量和位置变化。通过加入自噬诱导剂雷帕霉素(RAPA)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA),探讨细胞自噬与相关通路的关系及其在Fb致SUVEC细胞损伤中的作用。研究结果显示,40μg/m L Fb作用24 h后显著降低了SUVEC细胞存活率,20μg/m L的Fb作用48 h时显著降低细胞存活率,而不同浓度Fb作用72 h后均显著抑制细胞存活率;划痕处理后Fb作用24 h和48 h,观察细胞在24 h时向划痕中心迁移能力较强,在48 h时已呈零星散乱分布;透射电镜观察发现Fb处理组中出现双层膜结构的自噬小体;构建p EGFP-N1-FLAG-LC3质粒并转染细胞,在荧光显微镜下观察发现与对照组相比,LC3的荧光亮度逐渐聚集增强,并从细胞质逐渐向自噬体膜移动;q PCR和Wb结果显示自噬相关基因ATG5和beclin 1的表达上升,LC3II/LC3I比值上调,而P62的表达水平下降。以上结果表明一定浓度的Fb可以影响SUVEC细胞存活和迁移能力,诱导细胞自噬。对Fb作用后自噬相关通路的研究发现,PI3K、AKT和mTOR的m RNA和蛋白表达水平均下降,PI3K/AKT/mTOR信号通路被抑制;而AMPK的表达升高,抑制了mTOR的表达,AMPK/mTOR信号通路被激活。采用自噬诱导剂RAPA预处理3 h后,与单独Fb处理组相比,细胞存活率显著上升,mTOR和P62表达显著降低,LC3II/LC3I水平上升;用自噬抑制剂3-MA预处理6 h后,与单独Fb处理组相比,抑制剂预处理组的细胞存活率显著下降,PI3K和LC3II/LC3I表达水平下降,P62表达上升。以上结果表明Fb可能通过PI3K/AKT/mTOR和AMPK/mTOR信号通路来诱导细胞自噬发生,而细胞自噬可能在Fb致SUVEC细胞损伤中起保护作用。

关键词：伏马毒素b1 猪脐静脉血管内皮细胞细胞自噬 mTOR通路

伏马毒素b1诱导猪肺泡巨噬细胞的转录组和染色质开放性分析及紫檀芪对其缓解作用研究

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伏马毒素B1诱导猪肺泡巨噬细胞的转录组和染色质开放性分析及紫檀...

作者：靳健扬州大学

学位级别：硕士

伏马毒素b1（Fumonisin b1,Fb1）是伏马毒素化合物的主要组分。在大多数哺乳动物中,Fb1会引起肾毒性、肝毒性和肠道屏障功能紊乱,Fb1作用的分子机理有待系统阐明。本研究以猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophage cells,3D4/21）... 详细信息

伏马毒素b1（Fumonisin b1,Fb1）是伏马毒素化合物的主要组分。在大多数哺乳动物中,Fb1会引起肾毒性、肝毒性和肠道屏障功能紊乱,Fb1作用的分子机理有待系统阐明。本研究以猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophage cells,3D4/21）为实验材料,首先构建Fb1诱导3D4/21细胞模型,以探讨Fb1对3D4/21细胞毒性作用的影响,在此基础上,利用RNA-seq和ATAC-seq技术检测Fb1诱导后3D4/21细胞中的基因表达和转录调控情况,以期揭示Fb1的抗性表观遗传调控机制,进一步明确抗性功能基因。紫檀芪（Pterostilbene,PTE）作为一种天然植物性多酚类化合物,具有良好的抗炎、抗氧化和促进细胞再生的作用。为探索天然植物解毒剂对缓解真菌毒素诱导的细胞毒性作用,利用PTE挽救性处理Fb1诱导的3D4/21细胞,为今后将PTE用于生猪饲料添加剂的开发提供新的思路和实验依据。主要实验结果如下:1.利用CCK8法检测不同浓度（0、10、20、30、40、50和60μg/mL）Fb1处理3D4/21细胞在不同培养时间点（24、48、72 h）的细胞活性;3D4/21细胞活性随着Fb1的浓度升高而逐渐降低,其中50 μg/mL Fb1培养24 h组的3D4/21细胞存活率急剧下降至对照组的60.1%,在此条件下使用Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率,荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）含量;qRT-PCR检测细胞凋亡和炎症相关重要基因的表达变化。结果发现,50 μg/mLFb1培养24h可显著上调3D4/21细胞的总凋亡率和细胞内ROS水平（P＜0.01）;参与调控细胞凋亡的重要基因caspase-3、caspase-9和Puma和参与炎症反应相关重要基因IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β和IFN-γ的mRNA表达水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。由此表明,本研究成功构建Fb1诱导的3D4/21细胞损伤模型。2.将50 μg/mL Fb1诱导24 h的3D4/21细胞进行转录组和染色质开放性分析,RNA-seq共筛选到1536个差异表达基因,其中上调表达基因1012个,下调表达基因524个。这些差异基因主要富集于免疫系统过程（GO:0002376）、刺激反应（GO:0050896）、代谢过程（GO:0008152）、分子转导活性（GO:0060089）功能条目以及Toll样受体信号通路、NF-κb信号通路和鞘脂代谢等信号通路。qRT-PCR检测发现,差异表达基因FOXJ1、CLDN1、NFAT5、FN1、ID3、TXNIP、CCL2、IL-6、IL-8 和 SIGLEC1的表达趋势与RNA-seq测序结果一致。ATAC-seq共筛选出差异peak相关基因191个,其中差异上调peak 164个,差异下调peak 27个。这些差异peak主要富集于信号转导（GO:0023052）、免疫系统过程（GO:0002376）、代谢过程（GO:0008152）、催化活性（GO:0003824）、分子转导活性（GO:0060089）功能条目以及代谢途径、TRP通道的炎症介质调节、Jak-STAT信号通路、自噬-动物等信号通路。RNA-seq与ATAC-seq联合分析筛选出的24个表达趋势一致的上调表达候选基因,其中CXCR2基因作为CXCL8/IL-8的受体之一,推测其可能参与激活相关免疫调控通路,发挥Fb1的抗性调控作用。3.使用CCK8法测定显示不同浓度PTE（0、1、2、4、6、8和10 μg/mL）及其溶剂DMSO（0、1、2、4、6、8和10 μg/mL）均对3D4/21细胞不产生细胞毒性作用;不同浓度PTE与Fb1（50 μg/mL）的组合处理3D4/21细胞24h后,筛选出最适PTE保护浓度（4 μg/mL）。使用4 μg/mL PTE与50 μg/mL Fb1的组合处理3D4/21细胞24 h后细胞膜的完整性得到有效改善、LDH的释放量和细胞内ROS荧光强度显著下降（P＜0.01）。Fb1和PTE联合治疗后,可显著降低细胞凋亡及炎症反应相关基因caspase-3、caspase-9、IL-6、IL-12 和 IFN-β的表达量（P＜0.05）;PTE 的添加可显著降低Jak-STAT信号通路在相关基因JAK2、STAT3和CCL2的表达量（P＜0.05）。上述结果综合表明,本研究成功建立了 Fb1体外诱导3D4/21细胞的研究模型,从转录组和染色质开放性分析的角度初步揭示可能参与Fb1抗性的相关通路和下游调控基因,其中CXCR2基因作为CXCL8/IL-8的受体之一,可能参与激

关键词：猪伏马毒素b1 猪肺泡巨噬细胞转录组 ATAC 紫檀芪

伏马毒素b1单克隆抗体的制备及多种免疫学检测方法的建立

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伏马毒素B1单克隆抗体的制备及多种免疫学检测方法的建立

作者：王雨晨上海交通大学

学位级别：硕士

伏马毒素（Fumonisins）是由串珠镰刀菌产生的真菌毒素,目前已知有28种衍生物,其中以伏马毒素b1（Fb1）最为普遍,Fb1能够对玉米及其制品造成污染,以谷物为原料的一些产品中如面条、啤酒、调味品、动物饲料,甚至在芦笋中均检测到了Fb1。... 详细信息

伏马毒素（Fumonisins）是由串珠镰刀菌产生的真菌毒素,目前已知有28种衍生物,其中以伏马毒素b1（Fb1）最为普遍,Fb1能够对玉米及其制品造成污染,以谷物为原料的一些产品中如面条、啤酒、调味品、动物饲料,甚至在芦笋中均检测到了Fb1。Fb1毒性在伏马毒素中最强,研究也最为深入,对多种动物有较严重的毒理作用。研究表明伏马毒素b1可引发马的白脑软化症,猪的肺水肿综合症,此外,还可诱发人类的食道癌和肝癌、胃癌等疾病,对畜牧业和人类的健康构成危害。本研究在获得完全抗原,制备抗Fb1单克隆抗体的基础上,建立了针对Fb1的间接竞争ELISA、间接竞争磁酶免疫法及化学发光ELISA等多种检测方法,以期开发出适合不同检测样本,在不同条件下使用的特异性敏感的检测方法。 Fb1是一种不具备免疫原性的半抗原小分子,必须通过与载体蛋白的偶联获得免疫原性。本文通过戊二醛法将半抗原Fb1与载体蛋白钥孔血蓝蛋白（KLH）和蛋白卵清白蛋白（OVA）分别偶联成为完全抗原KLH-Fb1与OVA-Fb1,OVA-Fb1作为包被抗原建立ELISA方法;KLH-Fb1作为免疫原免疫8周龄bALb/C小鼠,应用细胞融合技术制备单克隆抗体。经三次亚克隆后,筛选出两株（6H3、6H11）能特异、稳定分泌抗Fb1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并选择其中一株细胞通过体内诱生腹水的方法制备单克隆抗体。经检测表明单克隆抗体的亚型为IgG1,轻链为κ型。采用Protein G亲和层析法纯化腹水中的单克隆抗体后,用SDS-PAGE对其纯度进行鉴定,结果发现单克隆抗体的纯度高,活性较好。采用间接ELISA测得纯化后腹水效价高达l:16000。特异性检测实验证实该抗体与玉米赤霉烯酮、黄曲霉素b1等结构类似物几乎不存在交叉反应,与其它结构的兽药氯丙嗪、链霉素等无交叉反应。利用获得的抗Fb1单克隆抗体,分别建立了间接竞争ELISA检测方法、间接竞争磁酶免疫法与化学发光ELISA检测方法。小分子的ELISA测定法一般有二种竞争检测模式:抗体包被直接竞争法、抗原包被直接竞争法以及间接竞争法。本研究利用制备的抗Fb1单克隆抗体建立了抗原包被间接竞争ELISA法对Fb1进行检测。间接竞争ELISA检测法,在包被抗原0.5μg/mL,一抗稀释度1:4000,二抗稀释度1:8000的条件下,检测灵敏度为0.44ng/mL,检测线性范围为0.44-73.06ng/mL,加标回收率在线性范围内达到78.4%-102%。虽然间接竞争ELISA方法比较繁琐,消耗的时间也相对长些,但是从结果看,与相关文献中的检测限对比,本实验的间接竞争ELISA检测灵敏度要高于直接竞争ELISA。并且,利用单克隆抗体建立的间接竞争ELISA方法,相比基于多克隆抗体建立的方法检测范围更广,灵敏度特异性更好。磁酶免疫检测方法是免疫磁珠在免疫检测领域最主要的应用,其采用免疫磁珠配合常规ELISA方法进行检测,具有良好的检测效果。本研究以磁性微球作为检测的固相载体,首先通过制备兔抗KLH多克隆抗体,使其于磁珠结合后,再将KLH-Fb1的偶联物包被与磁珠表面,形成外层包被有伏马毒素-KLH偶联物的免疫磁珠。结合间接竞争ELISA建立了磁酶免疫检测的方法。该方法在免疫磁珠稀释度1:20,一抗稀释度1:4000,二抗稀释度1:10000的条件下,检测灵敏度为0.24ng/mL,检测线性范围为0.54-26.3ng/mL,加标回收率在线性范围内达到80.4%-114.7%。由于免疫磁珠可均匀分布在样品溶液中,更易于接近靶物质,从而加快抗体与靶物质的结合速度,缩短了反应时间,从而提高了检测速率。此外,免疫磁珠可以利用磁性分离器方便地对所形成的复合物富集分离,使得洗涤结果更彻底、干扰物浓度极大降低和靶物质浓度有效富集,进而提高分析方法的信噪比和灵敏度。化学发光ELISA法是将免疫反应和化学发光反应相结合以检测抗原或抗体的免疫技术,化学发光酶免疫分析属酶免疫分析,只是酶反应的底物是发光剂,其余操作步骤与酶免分析完全相同。化学发光ELISA检测在包被抗原0.5μg/mL,一抗稀释度1:4000,二抗稀释度1:30000的条件下,检测灵敏度为0.13ng/mL,检测线性范围为0.28-37.2ng/mL。加标回收率在线性范围内达到82.3%-108.3%。该方法的检测下限为0.13ng/mL,可用于检测Fb1浓度较低的样品。与IMb-ELISA法相比,它具有更高的灵敏度,同时具有免疫分析法的成本低、速度快、特异性强、样品与处理简单和选择性强等优点,具有很大的发展前景。将3种检测方法与市售商品化的试剂盒进行比对,检测敏感度均高于试剂盒,符合检测要求,适合于谷物类产品及动物饲料中Fb1的安全监测和

关键词：伏马毒素b1 半抗原单克隆抗体间接竞争ELISA 间接竞争磁酶免疫法化学发光ELISA

伏马毒素b1对小鼠肠道的损伤及其分子机制的初步研究

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伏马毒素B1对小鼠肠道的损伤及其分子机制的初步研究

作者：黎晓雯佛山科学技术学院

学位级别：硕士

伏马毒素b(Fumonisin b,Fb)是一种霉菌毒素,可广泛污染农作物,并经食物链严重危害动物的健康。Fb与猪肺水肿、马脑白质软化、禽类腹泻、各类动物的肝肾损伤以及人的食管癌和胃肠道疾病等密切相关。肠道是机体消化吸收营养物质的主要场所... 详细信息

伏马毒素b(Fumonisin b,Fb)是一种霉菌毒素,可广泛污染农作物,并经食物链严重危害动物的健康。Fb与猪肺水肿、马脑白质软化、禽类腹泻、各类动物的肝肾损伤以及人的食管癌和胃肠道疾病等密切相关。肠道是机体消化吸收营养物质的主要场所,也是抵御有害物质的重要防御器官,但关于Fb对肠道损伤的研究还较少,所致肠道损伤的分子机制也不清楚。本实验从含伏马毒素玉米中提取Fb,采用HPLC-FLD对提取液中Fb进行定性定量检测,再利用提取液制备浓度为5mg/kg的Fb饲料;将80只4周龄雄性昆明小鼠随机均分为两组,对照组饲喂正常饲料,实验组饲喂Fb饲料,分别于21d和42d安乐死后采集十二指肠、回肠、盲肠和结肠组织,通过HE染色对4种肠道组织进行病理学分析,采用RT-q PCR检测7种炎症细胞因子、Keap1-Nrf2-HO-1抗氧化信号通路、11种CYP450酶系基因及异源物核受体芳香烃受体(AHR)、组成型雄甾烷受体(CAR)和孕烷X受体(PXR)的m RNA表达量,并利用Western blot对6种炎症细胞因子及异源物核受体AHR、CAR、PXR进行蛋白表达检测,试图初步探讨Fb对肠道的损伤及其分子机制。结果如下:(1)提取液中Fb的浓度为351.03165μg/m L。(2)Fb能破坏小鼠肠道粘膜层结构,引起肠道组织上皮细胞增生、毛细血管扩张、绒毛及上皮层脱落、肠腺萎缩坏死和炎性细胞浸润。(3)Fb能引起21d实验组中十二指肠和回肠IL-1β,盲肠NF-κb、TNF-α、TNF-R1、TNF-R2、COX-2、IL-6,结肠NF-κb、TNF-R1、TNF-R2、IL-1β的m RNA和十二指肠TNF-α、IL-1β、IL-10,回肠IL-1β、NF-κbp65,盲肠NF-κbp65、TNF-α、IL-1β、IL-10,结肠IL-4的蛋白表达增加。上调42d实验组中十二指肠NF-κb、TNF-R1、TNF-R2、IL-1β,回肠TNF-α、IL-6,盲肠NF-κb、TNF-α、TNF-R2、IL-6、IL-1β,结肠TNF-R1、IL-1β的m RNA和十二指肠NF-κbp65、IL-1β、IL-4、IL-10,回肠IL-1β、IL-4,盲肠NF-κbp65、IL-4,结肠IL-4的蛋白表达。(4)Fb导致21d实验组中十二指肠Nrf2,回肠和结肠Nrf2、HO-1以及盲肠Keap1的m RNA表达增加,42d实验组中回肠和盲肠Keap1、结肠Nrf2、HO-1的m RNA表达增加。(5)Fb导致21d实验组中十二指肠CYP2b1、CYP2b9、CYP2b10、CYP3族和CAR、PXR的m RNA表达上调,CYP1a1的m RNA和AHR的蛋白表达上调;回肠CYP3a11与PXR的m RNA表达上调;结肠CYP2b1、CYP3a11和PXR的m RNA表达上调。引起42d实验组中回肠CYP2b4、CYP2b9、CYP2b10、CYP2e1、CYP2f2、CYP2j5与CAR的m RNA表达上调,CYP1、CYP3族的m RNA与AHR、PXR的蛋白表达上调;盲肠除CYP2b1外,CYP1、CYP2族的m RNA表达、AHR、CAR的m RNA与蛋白表达,及CYP3族的m RNA和PXR的蛋白表达均上调。结果表明,饲料中含有5mg/kg的Fb会引起小鼠肠道组织出现病理性损伤,且该损伤涉及影响炎症细胞因子的表达水平,引起炎症反应,影响肠道的免疫功能;干扰Keap1-Nrf2-HO-1抗氧化信号通路的转录水平,降低抗氧化功能,破坏肠道氧化还原状态平衡;诱导异源物核受体AHR、CAR和PXR调节CYP450酶系的表达等三种分子机制。

关键词：伏马毒素b1 小鼠肠道炎症细胞因子 Keap1-Nrf2-HO-1抗氧化信号通路异源物核受体 CYP450酶系

伏马毒素b1对猪脐静脉血管内皮细胞增殖和屏障功能的影响

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伏马毒素B1对猪脐静脉血管内皮细胞增殖和屏障功能的影响

作者：袁巧玲湖南农业大学

学位级别：硕士

伏马毒素(Fums)是一种常见的霉菌毒素,主要污染玉米、小麦、大豆等粮食作物以及粮食加工产品,对畜禽养殖和人类健康造成很大威胁。Fums类型繁多,其中伏马毒素b(Fb)污染最广泛,毒性最大,因此Fb成为Fums研究的热点。Fb能危害多种动物,引... 详细信息

伏马毒素(Fums)是一种常见的霉菌毒素,主要污染玉米、小麦、大豆等粮食作物以及粮食加工产品,对畜禽养殖和人类健康造成很大威胁。Fums类型繁多,其中伏马毒素b(Fb)污染最广泛,毒性最大,因此Fb成为Fums研究的热点。Fb能危害多种动物,引起猪的主要症状是肺水肿,水肿液最先出现在血管周围,但其具体作用机制还不清楚。本文以猪脐静脉血管内皮细胞(SUVECs)为研究对象,研究Fb对SUVECs增殖和细胞屏障功能的影响,为Fb的毒性机制探讨及其防控提供依据。本文通过体外培养SUVECs细胞,用不同浓度Fb作用于细胞,采用MTT法检测细胞的活力,细胞HE染色和光学显微镜观察细胞的形态,比色法检测细胞上清液中LDH活性,流式细胞法检测细胞周期和细胞晚期凋亡率,q PCR和Western-blot检测细胞周期相关基因和蛋白的表达水平。通过扫描电镜观察细胞的基本形态,Transwell小室试验检测细胞旁通透性的变化,q PCR和Western-blot检测紧密连接相关基因和蛋白表达的水平,透射电镜观察细胞紧密连接超微结构的变化,鬼笔环肽染色观察细胞骨架的变化。结果表明,浓度为20-60μg/m L的Fb作用48 h和72 h后显著抑制SUVECs细胞活力。显微镜下可见,Fb处理组中细胞皱缩,细胞数量明显减少。10-40μg/m L的Fb处理组中细胞LDH活力显著提高,40μg/m L的Fb抑制了细胞由G1期向S期的推进,且Fb处理组细胞增殖指数显著降低,细胞晚期凋亡比例增加。q PCR和Western-blot结果显示,Fb处理组中细胞增殖指标PCNA的表达显著被抑制,同时调控细胞周期的相关细胞周期蛋白Cyclin b1、Cyclin D1、Cyclin E1和Cdc25c,以及细胞周期蛋白依赖性激酶CDK-4的表达显著下调。以上数据表明,Fb能抑制SUVECs细胞增殖。此外,扫描电镜观察发现Fb处理组中细胞基本形态结构发生改变,细胞皱缩变圆,伪足数量减少;Transwell检测结果表明细胞旁通透性显著增加。通过透射电镜观察到Fb处理组中的细胞紧密连接被破坏,细胞间出现空隙。鬼笔环肽染色结果显示Fb处理组中细胞骨架紊乱,细胞微丝排列散乱。同时,Fb处理组中细胞紧密连接相关基因Claudin 1、Occludin和ZO-1的基因表达和蛋白表达水平均显著下调。这表明Fb处理后能引起SUVECs的细胞屏障功能障碍,促使内皮细胞间连接减弱甚至破坏,进而可能会导致血管的通透性增加而促使渗出。

关键词：伏马毒素b1 猪脐静脉血管内皮细胞细胞增殖屏障功能

葡萄籽原花青素对伏马毒素b1致猪卵母细胞损伤的保护作用研究

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葡萄籽原花青素对伏马毒素B1致猪卵母细胞损伤的保护作用研究

作者：李文慧南京农业大学

学位级别：硕士

在迄今发现的众多伏马毒素中,伏马毒素b（Fb）分布最广、毒性最强,主要污染玉米和玉米制品,严重威胁人类和动物健康,其毒性作用与诱导氧化损伤与凋亡密切相关。葡萄籽原花青素（GSP）是从葡萄籽中提取的一种具有极强自由基清除能力的天... 详细信息

在迄今发现的众多伏马毒素中,伏马毒素b（Fb）分布最广、毒性最强,主要污染玉米和玉米制品,严重威胁人类和动物健康,其毒性作用与诱导氧化损伤与凋亡密切相关。葡萄籽原花青素（GSP）是从葡萄籽中提取的一种具有极强自由基清除能力的天然多酚类化合物,被广泛应用于疾病预防和治疗。玉米是猪饲料中重要的原料,且猪对Fb极为敏感,因此,本研究以体外成熟培养的猪卵母细胞为模型,研究Fb对猪卵母细胞可能的毒性作用以及GSP能否缓解Fb处理所引起的细胞损伤,并通过免疫荧光染色、q RT-PCR以及Western blotting等方法进一步探究了GSP的保护作用机制。相关研究结果为深入了解GSP对Fb诱导动物生殖毒性的保护性作用及其机制提供试验依据,也为临床上有效防治Fb所致的生殖损伤提供理论参考。主要研究内容及结果如下:一、GSP对经Fb处理猪卵母细胞体外成熟及细胞骨架结构的影响本试验旨在探究Fb对猪卵母细胞体外成熟的影响及GSP的保护作用。首先将猪卵丘-卵母细胞复合体（cumulus oocyte complexes,COCs）进行随机分组,在体外成熟培养过程中分别用不同浓度（20μM、30μM和40μM）Fb单独处理或与不同浓度（100μM、200μM和300μM）GSP共处理44 h,结果发现,当Fb浓度达到30μM时,卵母细胞第一极体（Pb1）排出率显著降低（Pb1排出率显著提高（Pbreakdown,GVbD）的细胞比例显著降低（Pb处理所引起的卵母细胞损伤作用。依据本试验结果,分别选取浓度为30μM Fb和200μM GSP用于后续GSP保护作用机制研究。二、GSP对经Fb处理猪卵母细胞线粒体功能及氧化应激的影响为进一步探究GSP改善Fb损伤的保护作用机制,将收集的COCs随机分为3组,即对照组、30μM Fb处理组,30μM Fb+200μM GSP共处理组,在体外成熟培养44 h后,分别采用Mito-Tracker Green、JC-1和ROS荧光染色检测细胞内线粒体分布、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）变化以及活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平。并在此基础上,进一步通过q RT-PCR技术分析了氧化应激相关基因的m RNA表达水平。结果发现,与Fb处理组相比,Fb+GSP共处理组卵母细胞的线粒体分布异常率显著降低（Pb处理所引起的线粒体功能障碍;同时GSP可通过上调抗氧化酶基因的表达提高卵母细胞的抗氧化能力,进而有效缓解Fb诱导的氧化应激损伤。三、GSP对经Fb处理猪卵母细胞早期凋亡和自噬的影响为进一步从细胞凋亡和自噬水平上探究GSP改善Fb致卵母细胞损伤的保护作用机制,将收集的COCs随机分为3组,即对照组、30μM Fb处理组,30μM Fb+200μM GSP共处理组,在体外成熟培养44 h后,分布采用Annexin V-FITC、LC3A/b荧光染色检测各组卵母细胞内早期凋亡和自噬水平。并在此基础上,进一步通过q RT-PCR和Western blotting分析了自噬/凋亡相关基因转录与蛋白的表达情况。结果发现,与Fb处理组相比,Fb+GSP共处理组卵母细胞的早期凋亡率显著降低（Pb荧光强度显著降低（PbAX（PbCL2（PbAX、bCL2和LC3A/b蛋白表达检测结果也与上述转录结果变化趋势一致。本研究结果表明Fb处理可引起卵母细胞发生早期

关键词：卵母细胞伏马毒素b1 葡萄籽原花青素线粒体功能凋亡自噬

基于单壁碳纳米管/壳聚糖检测伏马毒素b1的高效电化学传感器的研究

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基于单壁碳纳米管/壳聚糖检测伏马毒素B1的高效电化学传感器的研究

作者：杨弦弦重庆医科大学

学位级别：硕士

伏马毒素(Fumonisins,Fbs)是一类主要由镰刀菌属产生的真菌毒素,主要污染玉米及其制品,其中以伏马毒素b1(Fumonisin b1,Fb1)的污染水平最高,毒性最强。本研究研发设计了一种基于单壁碳纳米管/壳聚糖(SWNTs/CS)的电化学免疫传感器,可以... 详细信息

伏马毒素(Fumonisins,Fbs)是一类主要由镰刀菌属产生的真菌毒素,主要污染玉米及其制品,其中以伏马毒素b1(Fumonisin b1,Fb1)的污染水平最高,毒性最强。本研究研发设计了一种基于单壁碳纳米管/壳聚糖(SWNTs/CS)的电化学免疫传感器,可以高效灵敏地检测玉米样品中Fb1的含量。首先,伏马毒素b1-牛血清白蛋白(Fb1-bSA)通过与功能性SWNTs/CS共价结合到玻碳电极(GCE)表面。然后,利用游离Fb1和不同浓度的Fb1-bSA竞争性的结合定量Fb1单克隆抗体。最后,在电极表面滴加碱性磷酸酶标记的抗兔IgG的二抗(ALP-anti-antibody),通过ALP催化反应底物中的α-萘酚磷酸盐(α-NP)产生电化学信号。该免疫传感器的检测Fb1的线性范围为0.01-1000 ng/mL,检出限可达2 pg/mL,远低于欧盟立法规定的2-4mg/L的最低检出限。此外,用该传感器检测添加Fb1和自然污染的玉米样品,获得良好的回收率(96.34-115.95%),且检测结果与高效液相色谱法(HPLC)相比具有高度的一致性。总之,我们成功的构建了一种高灵敏性、高特异性和重现性好的免疫传感器,该传感器以市场为导向,将成为农业和食品安全领域定量检测Fb1的一种有力工具。

关键词：伏马毒素b1 电化学免疫传感器单壁碳纳米管/壳聚糖玉米