伏马毒素B1对猪脐静脉血管内皮细胞增殖和屏障功能的影响

作     者：袁巧玲 

作者单位：湖南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：苏建明

授予年度：2020年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：伏马毒素B1 猪脐静脉血管内皮细胞 细胞增殖 屏障功能 

摘      要：伏马毒素(Fums)是一种常见的霉菌毒素,主要污染玉米、小麦、大豆等粮食作物以及粮食加工产品,对畜禽养殖和人类健康造成很大威胁。Fums类型繁多,其中伏马毒素B(FB)污染最广泛,毒性最大,因此FB成为Fums研究的热点。FB能危害多种动物,引起猪的主要症状是肺水肿,水肿液最先出现在血管周围,但其具体作用机制还不清楚。本文以猪脐静脉血管内皮细胞(SUVECs)为研究对象,研究FB对SUVECs增殖和细胞屏障功能的影响,为FB的毒性机制探讨及其防控提供依据。本文通过体外培养SUVECs细胞,用不同浓度FB作用于细胞,采用MTT法检测细胞的活力,细胞HE染色和光学显微镜观察细胞的形态,比色法检测细胞上清液中LDH活性,流式细胞法检测细胞周期和细胞晚期凋亡率,q PCR和Western-blot检测细胞周期相关基因和蛋白的表达水平。通过扫描电镜观察细胞的基本形态,Transwell小室试验检测细胞旁通透性的变化,q PCR和Western-blot检测紧密连接相关基因和蛋白表达的水平,透射电镜观察细胞紧密连接超微结构的变化,鬼笔环肽染色观察细胞骨架的变化。结果表明,浓度为20-60μg/m L的FB作用48 h和72 h后显著抑制SUVECs细胞活力。显微镜下可见,FB处理组中细胞皱缩,细胞数量明显减少。10-40μg/m L的FB处理组中细胞LDH活力显著提高,40μg/m L的FB抑制了细胞由G1期向S期的推进,且FB处理组细胞增殖指数显著降低,细胞晚期凋亡比例增加。q PCR和Western-blot结果显示,FB处理组中细胞增殖指标PCNA的表达显著被抑制,同时调控细胞周期的相关细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E1和Cdc25c,以及细胞周期蛋白依赖性激酶CDK-4的表达显著下调。以上数据表明,FB能抑制SUVECs细胞增殖。此外,扫描电镜观察发现FB处理组中细胞基本形态结构发生改变,细胞皱缩变圆,伪足数量减少;Transwell检测结果表明细胞旁通透性显著增加。通过透射电镜观察到FB处理组中的细胞紧密连接被破坏,细胞间出现空隙。鬼笔环肽染色结果显示FB处理组中细胞骨架紊乱,细胞微丝排列散乱。同时,FB处理组中细胞紧密连接相关基因Claudin 1、Occludin和ZO-1的基因表达和蛋白表达水平均显著下调。这表明FB处理后能引起SUVECs的细胞屏障功能障碍,促使内皮细胞间连接减弱甚至破坏,进而可能会导致血管的通透性增加而促使渗出。