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猪脐静脉血管内皮细胞分离培养和鉴定

湖南畜牧兽医 2015年第3期 12-15页

作者：谢杨张居作彭璇左剑波薛立群湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128 湖南省畜牧兽医研究所湖南长沙410131

为了建立成熟的猪脐静脉血管内皮细胞（SUVECs）分离培养和鉴定体系,采用1%的I型胶原酶灌注法分离细胞,计数板计数,以10%1640培养基于37℃、5%CO2条件下培养;待融合80%左右胰蛋白酶消化1：2传代,利用倒置显微镜观察细胞生长状态及形态;... 详细信息

为了建立成熟的猪脐静脉血管内皮细胞（SUVECs）分离培养和鉴定体系,采用1%的I型胶原酶灌注法分离细胞,计数板计数,以10%1640培养基于37℃、5%CO2条件下培养;待融合80%左右胰蛋白酶消化1：2传代,利用倒置显微镜观察细胞生长状态及形态;采用血管性血友病因子（VWF）和血小板-内皮细胞粘附分子（PECAM-1/CD31）进行免疫荧光细胞鉴定;利用ICELLigence细胞功能分析仪测定细胞活力和生长曲线。研究从30头新生仔猪脐带（8-15cm）中分离到超过107个细胞,VWF和CD31双重检测阳性,分离得到的SUVECs超过90%,细胞生长状态良好,呈小三角形、椭圆形、梭形、多边形单层生长,界限清晰,融合后呈铺路石状,增殖能力强,符合血管内皮细胞的基本特征,可培养超过15代,为进一步研究猪胎盘血管发生及其对母猪生产性能影响提供可靠细胞模型。

关键词：猪脐静脉血管内皮细胞分离培养 VWF CD31 生长曲线

分子伴侣Jiv90基因的克隆及其在猪脐静脉血管内皮细胞中的表达

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动物医学进展 2010年第6期31卷 26-30页

作者：刘伟杨幼聪李宇立张彦明西北农林科技大学动物医学院陕西杨陵712100

为研究分子伴侣Jiv90对猪瘟病毒复制的影响,克隆了分子伴侣Jiv90基因,构建了真核表达载体并在猪脐静脉血管内皮细胞中表达。根据牛的Jiv90基因序列和真核表达载体pEGFP-C1设计引物,经PCR扩增,成功克隆到猪Jiv90基因,回收后与pEGFP-C1载... 详细信息

为研究分子伴侣Jiv90对猪瘟病毒复制的影响,克隆了分子伴侣Jiv90基因,构建了真核表达载体并在猪脐静脉血管内皮细胞中表达。根据牛的Jiv90基因序列和真核表达载体pEGFP-C1设计引物,经PCR扩增,成功克隆到猪Jiv90基因,回收后与pEGFP-C1载体连接,构建重组表达载体pEGFP-C1-Jiv90,提取质粒并采用脂质体法转染猪脐静脉血管内皮细胞。转染24 h后,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,经G418抗性筛选得到阳性克隆。本研究成功构建了pEGFP-C1-Jiv90真核表达载体,得到稳定表达Jiv90的细胞株,为今后开展分子伴侣对猪瘟病毒复制影响的研究奠定了基础。

关键词：猪瘟病毒真核表达猪脐静脉血管内皮细胞 Jiv90基因

伏马毒素B1对猪脐静脉血管内皮细胞增殖和屏障功能的影响

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伏马毒素B1对猪脐静脉血管内皮细胞增殖和屏障功能的影响

作者：袁巧玲湖南农业大学

学位级别：硕士

伏马毒素(Fums)是一种常见的霉菌毒素,主要污染玉米、小麦、大豆等粮食作物以及粮食加工产品,对畜禽养殖和人类健康造成很大威胁。Fums类型繁多,其中伏马毒素B(FB)污染最广泛,毒性最大,因此FB成为Fums研究的热点。FB能危害多种动物,引... 详细信息

伏马毒素(Fums)是一种常见的霉菌毒素,主要污染玉米、小麦、大豆等粮食作物以及粮食加工产品,对畜禽养殖和人类健康造成很大威胁。Fums类型繁多,其中伏马毒素B(FB)污染最广泛,毒性最大,因此FB成为Fums研究的热点。FB能危害多种动物,引起猪的主要症状是肺水肿,水肿液最先出现在血管周围,但其具体作用机制还不清楚。本文以猪脐静脉血管内皮细胞(SUVECs)为研究对象,研究FB对SUVECs增殖和细胞屏障功能的影响,为FB的毒性机制探讨及其防控提供依据。本文通过体外培养SUVECs细胞,用不同浓度FB作用于细胞,采用MTT法检测细胞的活力,细胞HE染色和光学显微镜观察细胞的形态,比色法检测细胞上清液中LDH活性,流式细胞法检测细胞周期和细胞晚期凋亡率,q PCR和Western-blot检测细胞周期相关基因和蛋白的表达水平。通过扫描电镜观察细胞的基本形态,Transwell小室试验检测细胞旁通透性的变化,q PCR和Western-blot检测紧密连接相关基因和蛋白表达的水平,透射电镜观察细胞紧密连接超微结构的变化,鬼笔环肽染色观察细胞骨架的变化。结果表明,浓度为20-60μg/m L的FB作用48 h和72 h后显著抑制SUVECs细胞活力。显微镜下可见,FB处理组中细胞皱缩,细胞数量明显减少。10-40μg/m L的FB处理组中细胞LDH活力显著提高,40μg/m L的FB抑制了细胞由G1期向S期的推进,且FB处理组细胞增殖指数显著降低,细胞晚期凋亡比例增加。q PCR和Western-blot结果显示,FB处理组中细胞增殖指标PCNA的表达显著被抑制,同时调控细胞周期的相关细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E1和Cdc25c,以及细胞周期蛋白依赖性激酶CDK-4的表达显著下调。以上数据表明,FB能抑制SUVECs细胞增殖。此外,扫描电镜观察发现FB处理组中细胞基本形态结构发生改变,细胞皱缩变圆,伪足数量减少;Transwell检测结果表明细胞旁通透性显著增加。通过透射电镜观察到FB处理组中的细胞紧密连接被破坏,细胞间出现空隙。鬼笔环肽染色结果显示FB处理组中细胞骨架紊乱,细胞微丝排列散乱。同时,FB处理组中细胞紧密连接相关基因Claudin 1、Occludin和ZO-1的基因表达和蛋白表达水平均显著下调。这表明FB处理后能引起SUVECs的细胞屏障功能障碍,促使内皮细胞间连接减弱甚至破坏,进而可能会导致血管的通透性增加而促使渗出。

关键词：伏马毒素B1 猪脐静脉血管内皮细胞细胞增殖屏障功能

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猪细胞周期蛋白A基因的克隆及其功能研究

畜牧兽医学报 2010年第4期41卷 469-477页

作者：范丽唐青海张彦明刘伟仝刚西北农林科技大学动医学院杨凌712100

本研究旨在克隆猪细胞周期蛋白A基因(CyclinA),并在猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)中表达,以验证其功能。以人的CyclinA基因为信息探针,经电子克隆得到猪CyclinA基因,通过RT-PCR和DNA测序验证电子克隆结果并对其作生物信息学分析,用RT-PCR... 详细信息

本研究旨在克隆猪细胞周期蛋白A基因(CyclinA),并在猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)中表达,以验证其功能。以人的CyclinA基因为信息探针,经电子克隆得到猪CyclinA基因,通过RT-PCR和DNA测序验证电子克隆结果并对其作生物信息学分析,用RT-PCR、Westernblot研究它在SUVEC中的表达情况。应用激光共聚焦显微镜分析它在细胞中的亚细胞定位,并通过流式细胞仪分析细胞周期以及用MTS法测定细胞的增殖能力。结果如下:核酸测序证明RT-PCR产物同电子克隆结果相符。该cDNA包含1299bp的完整开放阅读框(ORF),共编码432个氨基酸,经NCBIBLAST分析,该基因定位于猪的8号染色体上。Westernblot结果显示CyclinA基因编码蛋白的相对分子质量大小约为40ku,亚细胞定位研究表明该蛋白定位于细胞核中。经流式细胞仪分析表明稳定表达该基因的细胞,其G1期的细胞数量比对照组细胞增加了15%～20%,而S期的细胞数量比对照组细胞减少了约18%;MTS法检测显示细胞株SUVEC-CycAGFP的增殖活性明显高于对照组细胞。作者成功克隆到新基因猪源细胞周期蛋白A,并验证了其生物学功能,为今后开展病毒感染对猪细胞周期蛋白A影响的研究奠定了基础。

关键词：猪细胞周期蛋白A基因克隆猪脐静脉血管内皮细胞真核表达细胞周期 MTS

稳定表达猪miRNA let-7c细胞株的建立及其对CSFV的调控作用

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2010年第12期38卷 1-6,12页

作者：张旭张彦明张倩程媛媛谭晓妮西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

【目的】构建含有let-7c前体基因的重组质粒pGene-pre-let-7c,建立稳定表达猪miRNAlet-7c细胞株,研究let-7c对猪瘟病毒(CSFV)复制的调控作用。【方法】利用RNA22软件筛选出CSFV基因组3′-UTR潜在的let-7c结合位点,PCR扩增出let-7c前体片... 详细信息

【目的】构建含有let-7c前体基因的重组质粒pGene-pre-let-7c,建立稳定表达猪miRNAlet-7c细胞株,研究let-7c对猪瘟病毒(CSFV)复制的调控作用。【方法】利用RNA22软件筛选出CSFV基因组3′-UTR潜在的let-7c结合位点,PCR扩增出let-7c前体片段,连接到表达载体pGenesil-1.1-dBm2上,构建重组质粒pGene-pre-let-7c,采用脂质体法将重组质粒转染猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),经G418抗性压力筛选获得阳性细胞株。对获得的阳性细胞株进行接毒试验,检测CSFV的复制情况。用MTT比色法检测阳性细胞的增殖情况。【结果】成功扩增出let-7c前体基因,并构建了pGene-pre-let-7c重组质粒。重组质粒转染SUVEC细胞后筛选获得了稳定表达let-7c的细胞株。let-7c可下调CSFV在细胞中的复制。【结论】let-7c可下调CSFV的RNA复制水平。

关键词：猪瘟病毒猪脐静脉血管内皮细胞 miRNA let-7c

猪血管内皮细胞中与猪瘟病毒相关microRNA的初步筛选

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畜牧兽医学报 2010年第5期41卷 576-580页

作者：侯勃张彦明朱晓娟康恺代晨唐青海西北农林科技大学动物医学院杨凌712100

本试验旨在筛选猪脐静脉血管内皮细胞(SUVECs)内作用于猪瘟病毒(CSFV)的microRNA。通过构建CSFV3′和5′非翻译区(Untranslated region,UTR)的双荧光素酶报告基因载体,经生物信息学预测可能与CSFV相互作用的microRNA,然后瞬时共转染重... 详细信息

本试验旨在筛选猪脐静脉血管内皮细胞(SUVECs)内作用于猪瘟病毒(CSFV)的microRNA。通过构建CSFV3′和5′非翻译区(Untranslated region,UTR)的双荧光素酶报告基因载体,经生物信息学预测可能与CSFV相互作用的microRNA,然后瞬时共转染重组载体与microRNA的抑制物,最后通过发光检测仪测定荧光素酶活性。结果表明,成功构建了CSFV5′非翻译区(373 bp)和3′非翻译区(252 bp)的报告基因载体,并合成了4条预测出的microRNA(ssc-mi R-let7c、ssc-mi R-106a、ssc-mi R-18、ssc-mi R-139)的抑制物,共转染后发光检测仪检测到荧光素酶的活性被不同程度抑制。本研究发现microRNA作用位点主要在CSFV的3′-UTR,而且以上4种microRNA都对CSFV3′-UTR有不同程度的抑制作用,其中ssc-mi R-18的抑制作用比较明显。

关键词：猪瘟病毒 microRNA 猪脐静脉血管内皮细胞

经猪血管内皮细胞多次传代的CSFV E2基因的遗传变异研究

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2008年第8期36卷 31-35页

作者：温元鹏张彦明冶贵生邓文熊奎州王学艳西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

【目的】研究猪瘟病毒（CSFV）E2基因在猪脐静脉血管内皮细胞中多次传代后的遗传变异情况,为CSFV的致病机理研究提供理论依据。【方法】分离并培养猪脐静脉血管内皮细胞,接种猪瘟病毒石门株脾毒后继续培养,染毒细胞经3次连续传代后全部... 详细信息

【目的】研究猪瘟病毒（CSFV）E2基因在猪脐静脉血管内皮细胞中多次传代后的遗传变异情况,为CSFV的致病机理研究提供理论依据。【方法】分离并培养猪脐静脉血管内皮细胞,接种猪瘟病毒石门株脾毒后继续培养,染毒细胞经3次连续传代后全部死亡、脱落,收集每代细胞并提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增CSFVE2基因。将获得的目的基因克隆入T载体并转化DH5α感受态细胞,提取重组质粒,进行PCR和BamHⅠ、HindⅢ酶切鉴定,将阳性的重组质粒进行测序,并用DNAStar软件进行序列分析。【结果】扩增出了E2基因,重组质粒PMD18-T-E2的PCR和双酶切鉴定结果表明,E2基因与pMD18-T载体连接成功。各代猪脐静脉血管内皮细胞中CSFVE2基因之间的核苷酸序列同源性为99.4%-99.9%,氨基酸序列同源性为98.9%-99.8%;各代猪脐静脉血管内皮细胞中的CSFVE2基因与标准病毒石门株之间的核苷酸序列同源性为98.9%-99.3%,氨基酸序列同源性为98.9%-99.2%。【结论】猪瘟病毒石门株在猪血管内皮细胞上传代的过程中E2基因无明显的变异,能保持遗传的稳定性。

关键词：猪瘟病毒 E2基因猪脐静脉血管内皮细胞序列分析

猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2009年第5期37卷 7-11页

作者：徐彦召张彦明何雷唐青海代晨王静杨小云西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pS... 详细信息

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。

关键词：猪瘟病毒囊膜蛋白猪脐静脉血管内皮细胞分泌型真核表达载体真核表达

SUVEC多次传代的CSFV E2基因遗传变异及转染Y8基因细胞株的建立

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SUVEC多次传代的CSFV E2基因遗传变异及转染Y8基因细胞株的建立

作者：温元鹏西北农林科技大学

学位级别：硕士

研究发现猪瘟病毒不是对猪的所有体细胞都有致细胞病变作用（CPE）,而只是对与CSFV具有高度亲和力的细胞有CPE的作用。位于病毒粒子表面的E2蛋白在病毒感染进入细胞的过程中,可与宿主细胞表面的E2特异性受体相互作用,从而介导病毒进入... 详细信息

研究发现猪瘟病毒不是对猪的所有体细胞都有致细胞病变作用（CPE）,而只是对与CSFV具有高度亲和力的细胞有CPE的作用。位于病毒粒子表面的E2蛋白在病毒感染进入细胞的过程中,可与宿主细胞表面的E2特异性受体相互作用,从而介导病毒进入细胞中,用一定浓度的E2蛋白可完全阻断CSFV对体外培养细胞的感染过程。因此,E2蛋白对病毒感染细胞进而增殖引起细胞病变具有重要作用。研究表明猪瘟病毒引起猪脐静脉血管内皮细胞（SUVEC）发生CPE的原因可能是猪血管内皮细胞被猪瘟病毒感染后刺激某种/某些敏感基因,表达了某种/某些蛋白酶,将猪瘟病毒的p125蛋白裂解成为p80蛋白所致。本研究将猪瘟病毒在血管内皮细胞上多次传代后,采用分子生物学方法和软件分析猪瘟病毒E2基因的遗传变异情况,同时在前期工作的基础上,从4个敏感基因中选出了Y8基因,将其转入PK-15细胞中,为其基因功能及猪瘟病毒致病机理的研究奠定了基础。 1.无菌采取猪脐带,分离脐静脉,用胶原酶消化分离内皮细胞,于37℃、5%的CO2条件下培养。培养的细胞为单层贴壁生长,呈铺路石状。待原代细胞铺满80%左右,接种猪瘟石门株脾毒,待细胞铺满后将细胞传代,并收集每代细胞。结果原代的猪血管内皮细胞接毒后,经2次传代,细胞开始有空泡样病变,经3次传代,细胞脱落死亡。 2.收集每代细胞毒,提取猪瘟病毒RNA,用E2基因特异性引物进行RT-PCR,得到目的基因E2,连接到载体pMD18-T上,得到重组质粒pMD18-T-E2,进行核苷酸测序。结果表明,目的基因插入方向、大小、位置、读码框及核苷酸序列均正确,得到了重组质粒pMD18-T-E2。用DNA Star软件分析结果表明,各代细胞CSFV之间的核苷酸同源性为99.4%～99.9%,氨基酸的同源性为98.9%～99.8%,各代细胞病毒与标准猪瘟病毒石门株的核苷酸的同源性为98.9%～99.3%,氨基酸的同源性为98.9%～99.2%。 3.利用特异性引物扩增出Y8基因,连接到T载体上,经鉴定后与表达载体pEGFP-C1连接,得到重组质粒pEGFP-Y8。将纯化后的重组载体和空载体pEGFP-C1转染PK-15细胞,由最佳G418浓度抗性筛选14d后获得阳性细胞,得到了2株能持久转录Y8基因的PK-15细胞株和1株能持久转录pEGFP-C1的PK-15细胞株。

关键词：猪瘟病毒 E2基因猪脐静脉血管内皮细胞序列分析 Y8基因