葡萄籽原花青素对伏马毒素B1致猪卵母细胞损伤的保护作用研究
作者单位：南京农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：剧世强
授予年度：2021年
主 题：卵母细胞 伏马毒素B1 葡萄籽原花青素 线粒体功能 凋亡 自噬
摘 要：在迄今发现的众多伏马毒素中,伏马毒素B（FB）分布最广、毒性最强,主要污染玉米和玉米制品,严重威胁人类和动物健康,其毒性作用与诱导氧化损伤与凋亡密切相关。葡萄籽原花青素（GSP）是从葡萄籽中提取的一种具有极强自由基清除能力的天然多酚类化合物,被广泛应用于疾病预防和治疗。玉米是猪饲料中重要的原料,且猪对FB极为敏感,因此,本研究以体外成熟培养的猪卵母细胞为模型,研究FB对猪卵母细胞可能的毒性作用以及GSP能否缓解FB处理所引起的细胞损伤,并通过免疫荧光染色、q RT-PCR以及Western blotting等方法进一步探究了GSP的保护作用机制。相关研究结果为深入了解GSP对FB诱导动物生殖毒性的保护性作用及其机制提供试验依据,也为临床上有效防治FB所致的生殖损伤提供理论参考。主要研究内容及结果如下:一、GSP对经FB处理猪卵母细胞体外成熟及细胞骨架结构的影响本试验旨在探究FB对猪卵母细胞体外成熟的影响及GSP的保护作用。首先将猪卵丘-卵母细胞复合体（cumulus oocyte complexes,COCs）进行随机分组,在体外成熟培养过程中分别用不同浓度（20μM、30μM和40μM）FB单独处理或与不同浓度（100μM、200μM和300μM）GSP共处理44 h,结果发现,当FB浓度达到30μM时,卵母细胞第一极体（PB1）排出率显著降低（P0.01）,但当用200μM GSP共处理后,猪卵母细胞的PB1排出率显著提高（P0.05）,激活后的卵裂率和囊胚发育率也进一步恢复;细胞周期分析结果表明,200μM GSP共处理使阻滞在生发泡破裂期（germinal vesicle breakdown,GVBD）的细胞比例显著降低（P0.01）,成功发育至第二次减数分裂中期（Metaphase II）期细胞比例明显升高（P0.05）,同时卵母细胞中纺锤体异常的比例显著降低（P0.01）、微丝分布进一步增加（P0.05）。这些结果表明,用200μM GSP共处理可通过修复细胞骨架结构,恢复减数分裂进程,进而显著改善经FB处理所引起的卵母细胞损伤作用。依据本试验结果,分别选取浓度为30μM FB和200μM GSP用于后续GSP保护作用机制研究。二、GSP对经FB处理猪卵母细胞线粒体功能及氧化应激的影响为进一步探究GSP改善FB损伤的保护作用机制,将收集的COCs随机分为3组,即对照组、30μM FB处理组,30μM FB+200μM GSP共处理组,在体外成熟培养44 h后,分别采用Mito-Tracker Green、JC-1和ROS荧光染色检测细胞内线粒体分布、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）变化以及活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平。并在此基础上,进一步通过q RT-PCR技术分析了氧化应激相关基因的m RNA表达水平。结果发现,与FB处理组相比,FB+GSP共处理组卵母细胞的线粒体分布异常率显著降低（P0.05）,去极化的MMP也明显恢复（P0.05）;进一步研究发现GSP共处理后卵母细胞ROS水平显著降低（P0.01）,氧化应激相关基因CAT（P0.001）、SOD2（P0.05）和GSH-Px（P0.05）的转录水平也明显升高。本研究结果表明GSP可通过改善卵母细胞线粒体异常分布,升高MMP,进而恢复FB处理所引起的线粒体功能障碍;同时GSP可通过上调抗氧化酶基因的表达提高卵母细胞的抗氧化能力,进而有效缓解FB诱导的氧化应激损伤。三、GSP对经FB处理猪卵母细胞早期凋亡和自噬的影响为进一步从细胞凋亡和自噬水平上探究GSP改善FB致卵母细胞损伤的保护作用机制,将收集的COCs随机分为3组,即对照组、30μM FB处理组,30μM FB+200μM GSP共处理组,在体外成熟培养44 h后,分布采用Annexin V-FITC、LC3A/B荧光染色检测各组卵母细胞内早期凋亡和自噬水平。并在此基础上,进一步通过q RT-PCR和Western blotting分析了自噬/凋亡相关基因转录与蛋白的表达情况。结果发现,与FB处理组相比,FB+GSP共处理组卵母细胞的早期凋亡率显著降低（P0.05）,LC3 A/B荧光强度显著降低（P0.05）;促凋亡相关基因BAX（P0.01）、CASPASE3（P0.001）和自噬相关基因LC3（P0.001）及ATG5（P0.05）的转录水平明显降低,抗凋亡基因BCL2（P0.001）和自噬相关基因m TOR（P0.001）的转录水平显著升高,且BAX、BCL2和LC3A/B蛋白表达检测结果也与上述转录结果变化趋势一致。本研究结果表明FB处理可引起卵母细胞发生早期
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