伏马毒素B1在猪卵母细胞成熟过程中的毒性作用

作     者：曹伟 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：剧世强

授予年度：2019年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪 卵母细胞 伏马毒素B1 氧化应激 凋亡 

摘      要：伏马毒素(Fumonisins)是由串珠镰刀菌和再育镰刀菌等真菌产生,其包含多种毒素及其衍生物,广泛分布于世界各地的粮食作物中,主要污染玉米和玉米制品,是目前谷物污染的主要霉菌毒素之一。在已知的众多伏马毒素衍生物中,B系列检出率最高,其中,伏马毒素B1(FB1)性质稳定,在畜禽的各种产品中均能检测到其存在,且分布广毒性大。现已发现,动物摄取经FB1污染的食物后,会产生明显的肝肾毒性、神经毒性、免疫毒性、致癌性等毒性效应。但FB1是否会对动物生殖细胞也产生毒性作用、造成何种损伤目前尚不明确。本研究以体外成熟的猪卵母细胞为研究对象,探究FB1对猪卵母细胞成熟的影响,并通过间接免疫荧光结合共聚焦成像技术分析FB1对卵母细胞减数分裂进程中细胞超微骨架的影响,在此基础之上,进一步从细胞氧化还原状态以及氧化应激相关基因的表达水平进行研究,分析FB1对卵母细胞的毒性作用是否与细胞氧化损伤相关,以期为临床上有效防治FB1所致的生殖毒性损伤提供重要的实验参考。主要研究内容及结果如下:一、伏马毒素B1对猪卵母细胞体外成熟的影响本试验旨在研究伏马毒素B1(FB1)对猪卵母细胞体外成熟的影响,探讨FB1是否会对猪卵母细胞产生毒性损伤。将猪卵母细胞置于含有不同浓度FB1的培养液中,体外成熟培养至44h,镜下观察卵丘扩散及第一极体排出情况;通过间接免疫荧光结合共聚焦成像技术分析FB1对卵母细胞减数分裂进程及细胞超微骨架的影响。结果显示,FB1处理后COCs卵丘扩散受到明显抑制,且第一极体排出率显著下降,并与FB1作用浓度呈剂量依赖性;细胞周期检测结果表明FB1处理后,停滞在GVBD期的卵母细胞比例显著上升,并伴随有明显的染色体排列紊乱与纺锤体组装异常,与对照组相比差异显著。本试验结果表明,伏马毒素B1可显著抑制猪卵母细胞体外成熟,并引起细胞染色体排列紊乱、纺锤体结构异常,最终导致卵母细胞减数分裂阻滞在GVBD期。二、伏马毒素B1对猪卵母细胞氧化应激的影响为进一步研究FB1对猪卵母细胞的毒性作用,本试验从细胞氧化还原状态以及氧化应激相关基因的表达进行研究,分析FB1对卵母细胞的毒性作用是否与细胞氧化应激相关。通过收集经FB1处理后的猪卵母细胞,采用DCFH-DA法染色检测细胞ROS水平,Realtime-PCR检测氧化应激相关因子CAT、GSH-Px、SOD以及凋亡相关基因Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达情况。结果显示,经FB1处理后,猪卵母细胞ROS含量明显增加,氧化应激相关因子CAT、SOD1和SOD2的mRNA相对表达量也随之升高;进一步对凋亡相关基因检测发现,FB1处理导致卵母细胞CASPASE-3和BAX的mRNA表达显著升高,而BCL-2 mRNA水平则显著下降。这些研究结果表明伏马毒素B1可诱导猪卵细胞产生氧化应激,并促进细胞凋亡,最终导致卵母细胞成熟失败。