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二化螟味觉受体基因鉴定、克隆与表达模式分析

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中国农业科学 2023年第13期56卷 2504-2517页

作者：黄玉萱沈忱鞠佳菲杨磊罗光华方继朝南京农业大学植物保护学院江苏省农业科学院植物保护研究所/江苏省食品质量安全重点实验室(省部共建国家重点实验室培育基地)

【背景】二化螟(Chilo suppressalis)是我国水稻上的重要害虫之一，味觉受体(gustatory receptor,GR)基因在昆虫取食、产卵等过程中发挥重要作用。【目的】基于组学数据鉴定并克隆二化螟GR基因序列，明确其在不同发育阶段和成虫不同组... 详细信息

【背景】二化螟(Chilo suppressalis)是我国水稻上的重要害虫之一，味觉受体(gustatory receptor,GR)基因在昆虫取食、产卵等过程中发挥重要作用。【目的】基于组学数据鉴定并克隆二化螟GR基因序列，明确其在不同发育阶段和成虫不同组织中的表达特性，为后续深入研究二化螟GR基因的功能打下基础。【方法】结合二化螟转录组数据和其他昆虫的GR基因序列，通过多重序列比对，鉴定二化螟GR基因。利用RT-PCR方法克隆获得二化螟GR基因的完整开放阅读框(open reading frame,ORF)序列，运用生物信息学分析工具对二化螟GR基因编码的氨基酸序列进行分子生物学特征、结构域等分析；基于最大似然法构建二化螟GR基因蛋白序列与其他昆虫GR基因的系统进化树；利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法分析GR基因在二化螟不同发育阶段(1—6龄幼虫和雌、雄成虫)和成虫不同组织(雌、雄成虫的触角、头、翅、腹、足)中的表达模式。【结果】鉴定并克隆得到5个二化螟GR基因，分别命名为CsupGR1—5,ORF长度为1 122—1 428 bp，编码氨基酸序列长度为373—475 aa，其中CsupGR2、CsupGR4、CsupGR5具有7个跨膜结构域，CsupGR1、CsupGR3具有8个跨膜结构域。系统进化分析显示，CsupGR1、CsupGR2与黑腹果蝇DmelGR63a及小菜蛾PxylGR7、PxylGR8亲缘关系较近，属于CO2受体家族；CsupGR3与黑腹果蝇DmelGR43a及家蚕BmorGR9、BmorGR10亲缘关系较近，属于果糖/肌醇受体家族；CsupGR4、CsupGR5与黑腹果蝇DmelGR64及家蚕BmorGR5—8亲缘关系较近，属于糖受体家族。发育期表达谱分析表明，二化螟5个GR基因在不同发育时期均有表达，其中CsupGR1、CsupGR4均在雄成虫中高表达，CsupGR2在1龄幼虫和雄成虫中表达量最高，CsupGR3在成虫中高表达，CsupGR5在4龄幼虫中表达量最高；组织表达谱分析表明，5个GR基因在雌、雄成虫的各组织均有表达，其中CsupGR1、CsupGR5在成虫头部表达量高，CsupGR2—4在成虫触角部位高表达。【结论】鉴定克隆的5个二化螟GR基因均具有昆虫味觉受体基因的典型特征，且在成虫触角或头部高表达，推测这5个基因可能与二化螟识别和适应寄主植物有关。

关键词：二化螟味觉受体基因鉴定序列分析表达谱

二化螟dsRNA降解酶基因的克隆与表达分析

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植物保护学报 2023年第3期50卷 610-619页

作者：彭英传江婷朱玉麟张万娜张晶韩召军肖海军江西农业大学昆虫研究所南昌330045 南京农业大学植物保护学院农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室南京210095 北京林业大学草业与草原学院北京100083

为解析二化螟Chilo suppressalis体内参与降解双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)的关键核酸酶的功能,克隆二化螟不同的非专一性核酸酶(non-specific nuclease,NUC)基因,并对这些基因进行生物信息学分析和组织定量表达分析,同时对dsRN... 详细信息

为解析二化螟Chilo suppressalis体内参与降解双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)的关键核酸酶的功能,克隆二化螟不同的非专一性核酸酶(non-specific nuclease,NUC)基因,并对这些基因进行生物信息学分析和组织定量表达分析,同时对dsRNA降解酶(dsRNA degrading nuclease,dsRNase)活力的组织分布进行研究。结果显示,共克隆获得5个NUC基因,其中有4个编码dsRNase亚家族基因(CsdsRNase1~CsdsRNase4)和1个编码Endonuclease G亚家族基因(CsEndoG)。5个NUC基因的开放阅读框核苷酸序列长度范围为828~1338 bp,编码275~445个氨基酸残基,其分子量大小为31.68~49.57 kD,预测等电点为5.48~9.42。CsdsRNase1和CsdsRNase2含有信号肽序列,两者相似度极高,且与家蚕Bombyx mori和斜纹夜蛾Spodoptera litura中具有dsRNA降解酶活力的dsRNase同源聚类;CsdsRNase1和CsdsRNase2均在二化螟中肠中高表达,这与中肠组织超高的dsRNA降解酶活力分布模式一致,表明这2个基因可能是中肠参与降解dsRNA的关键核酸基因。二化螟体内存在多条dsRNase基因序列,尤其是中肠中高表达的CsdsRNase1和CsdsRNase2可影响二化螟体内dsRNA的稳定性,从而影响RNA干扰效率。

关键词：二化螟非专一性核酸酶基因克隆 RNA干扰 dsRNA降解酶

二化螟对双酰胺类杀虫剂抗性的分子机制研究进展

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农药学学报 2023年第2期25卷 257-266页

作者：徐鹿孙杨刘宝生徐德进徐广春赵钧张亚楠张月亮黄水金吴顺凡高聪芬江苏省农业科学院植物保护研究所省部共建国家重点实验室培育基地-江苏省食品质量安全重点实验室南京210014 南京农业大学植物保护学院南京210095 江西省农业科学院植物保护研究所南昌330200 河南省农业科学院烟草研究所河南许昌461000 淮北师范大学生命科学学院安徽淮北235000

新型双酰胺类杀虫剂已广泛用于保障水稻生产,而二化螟作为危害水稻生产的钻蛀性害虫,已经对该类杀虫剂产生了抗性,明确该类杀虫剂抗性分子机制,可为二化螟抗性快速检测和绿色防控提供技术支撑。本文在总结二化螟对双酰胺类杀虫剂抗性现... 详细信息

新型双酰胺类杀虫剂已广泛用于保障水稻生产,而二化螟作为危害水稻生产的钻蛀性害虫,已经对该类杀虫剂产生了抗性,明确该类杀虫剂抗性分子机制,可为二化螟抗性快速检测和绿色防控提供技术支撑。本文在总结二化螟对双酰胺类杀虫剂抗性现状的基础上,重点综述了近年来有关其抗性分子机制研究的进展,主要包括解毒酶和转运蛋白基因过表达介导的代谢抗性,以及鱼尼丁受体基因突变介导的靶标抗性;指出了该研究领域在抗性分子检测、抗性新基因鉴定、抗性基因调控网络和多重抗性机制等方面存在的问题,并展望了其发展方向,认为:利用高通量测序技术检测害虫种群抗药性;利用多组学技术鉴定新抗性基因及调控网络,以探明多重抗性机制;将反向遗传学工具放射性配基结合及电生理技术深入验证抗性基因功能;需开发靶向抗性基因的dsRNA转基因作物、纳米农药及选择性新型化学杀虫剂,以达到杀虫剂减施增效的目的。

关键词：二化螟双酰胺类杀虫剂代谢抗性靶标抗性抗性分子机制

二化螟P糖蛋白基因的克隆分析及对杀虫剂的诱导响应

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中国农业科学 2021年第19期54卷 4121-4131页

作者：孟祥坤吴赵露杨雪梅官道杰王建军扬州大学园艺与植物保护学院

【目的】克隆二化螟(Chilo suppressalis)P糖蛋白基因(CsPgp)并对其分子特征和表达模式进行分析,明确CsPgp对常用防治杀虫剂氯虫苯甲酰胺和阿维菌素的诱导响应并对其潜在的转录调控机制进行探索。【方法】使用基因克隆技术扩增CsPgp全... 详细信息

【目的】克隆二化螟(Chilo suppressalis)P糖蛋白基因(CsPgp)并对其分子特征和表达模式进行分析,明确CsPgp对常用防治杀虫剂氯虫苯甲酰胺和阿维菌素的诱导响应并对其潜在的转录调控机制进行探索。【方法】使用基因克隆技术扩增CsPgp全长基因序列,利用生物信息学技术对CsPgp编码蛋白的分子特征和5′端转录调控区中的转录因子结合位点进行分析。使用荧光定量PCR方法对CsPgp在二化螟不同龄期和不同组织中的表达模式及在杀虫剂氯虫苯甲酰胺和阿维菌素不同剂量处理下的诱导响应进行测定分析。【结果】CsPgp cDNA序列全长4 584 bp,由23个外显子构成,编码1 259个氨基酸,含有两个跨膜区和两个核苷酸结合区,具有ABC转运蛋白家族典型的结构特征,如对底物转运具有重要功能的Walker A、Walker B及D、H、P、Q-Loop等特征序列。CsPgp主要在二化螟幼虫期表达,在3—4龄幼虫中具有最高的表达量,在蛹期和成虫期的表达量较低。组织表达分析表明,CsPgp主要高表达于二化螟的前肠和中肠组织,在后肠、脂肪体、马氏管等其他组织中的表达量较低。相比于对照,使用LC和LC剂量氯虫苯甲酰胺分别处理二化螟3龄幼虫12 h和24 h后,CsPgp的表达量未发生显著变化。但在处理36 h后,LC处理组试虫中CsPgp显著上调表达,而LC处理组试虫中CsPgp则显著下调表达。使用低剂量0.05 mg·L的阿维菌素处理二化螟试虫12 h后,相比于对照,CsPgp显著下调表达,在处理24 h和36 h后CsPgp的表达水平没有发生显著变化,使用0.15 mg·L的阿维菌素处理二化螟试虫24 h和36 h后Cs Pgp被显著诱导上调表达。对CsPgp的5′端转录调控区的序列分析发现,在转录调控区中预测到多个转录因子结合位点,其中包括5个潜在的CncC结合位点。【结论】二化螟CsPgp在重要解毒代谢组织中肠中高表达,并且能够被杀虫剂氯虫苯甲酰胺和阿维菌素诱导表达,表明CsPgp可能参与对氯虫苯甲酰胺和阿维菌素的解毒代谢。CsPgp 5′端转录调控区中含有多个转录因子CncC结合位点,可能对CsPgp的转录表达具有重要调控作用。推测在氯虫苯甲酰胺或阿维菌素胁迫下,CsPgp可能受到转录因子CncC的转录调控并参与对氯虫苯甲酰胺或阿维菌素的解毒代谢。

关键词：二化螟 P糖蛋白分子特征杀虫剂诱导转录调控

水稻二化螟病原线虫N-Yz1的分离鉴定及其感染特性

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中国水稻科学 2022年第6期36卷 639-646页

作者：刘琴夏杨韩光杰李传明陆玉荣黄立鑫祁建杭徐健扬州绿源生物化工有限公司扬州225008 江苏里下河地区农业科学研究所/国家农业微生物扬州观测实验站扬州225007

【目的】二化螟是危害水稻的重要害虫,其钻蛀为害,防治困难,严重威胁水稻生产。本研究对感染二化螟昆虫病原线虫的分离筛选和感染特性进行研究,期望为水稻钻蛀害虫危害的防治提供新的途径和方法。【方法】自越冬代二化螟幼虫体内通过组... 详细信息

【目的】二化螟是危害水稻的重要害虫,其钻蛀为害,防治困难,严重威胁水稻生产。本研究对感染二化螟昆虫病原线虫的分离筛选和感染特性进行研究,期望为水稻钻蛀害虫危害的防治提供新的途径和方法。【方法】自越冬代二化螟幼虫体内通过组织分离筛选,获得野外感染二化螟的昆虫病原线虫,室内接种实验分析分离昆虫病原线虫对二化螟的感染活性和作用特性。【结果】自然罹死二化螟幼虫体内分离获得野外感染的昆虫病原线虫N-Yz1,接种4龄二化螟幼虫导致感染并死亡,后期虫体内产生大量形态一致的侵染期线虫(IJ)。形态学观察结合rDNA-ITS序列分析,鉴定分离昆虫病原线虫隶属于斯氏线虫属,与已鉴定种小卷蛾斯氏线虫同源性达99.87%。昆虫病原线虫N-Yz1对不同龄期二化螟幼虫都有较高感染致死作用,40头(IJ)的线虫接种剂量,对低龄(2~3龄)二化螟致死速度快、致死率高,接种24 h就出现感染致死个体,48 h后幼虫全部死亡。高龄幼虫(4~6龄)感染致死速度较慢,死亡高峰发生在接种线虫后的48 h。N-Yz1接种剂量与二化螟死亡率呈显著正相关,剂量超过30 IJs/头时,4龄二化螟感染死亡率达90%以上。N-Yz1对二化螟幼虫具有明显搜索能力,在距离寄主害虫0-30 cm的范围内,通过迁移扩散,感染二化螟并导致其死亡。【结论】分离昆虫病原线虫N-Yz1具有较强的感染致死能力,表现出防治水稻钻蛀害虫二化螟的潜在应用价值。

关键词：二化螟斯氏线虫分离鉴定感染特性

二化螟防御Cry蛋白过程中相关microRNA的鉴定及应用潜力研究

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二化螟防御Cry蛋白过程中相关microRNA的鉴定及应用潜力研究

作者：李真真华中农业大学

学位级别：硕士

二化螟(Chilo suppressalis)属鳞翅目害虫,是对我国水稻(Oryza sativa)产业为害最严重的害虫之一。Cry晶体蛋白是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)在孢子形成的过程中产生的杀虫蛋白,在防治二化螟等害虫中发挥巨大的作用。探索... 详细信息

二化螟(Chilo suppressalis)属鳞翅目害虫,是对我国水稻(Oryza sativa)产业为害最严重的害虫之一。Cry晶体蛋白是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)在孢子形成的过程中产生的杀虫蛋白,在防治二化螟等害虫中发挥巨大的作用。探索昆虫防御Cry杀虫蛋白的调控机制,为在实际生产中更好地利用Cry杀虫蛋白提供新的技术思路。Micro RNA(miRNA)可参与调控生物的许多重要生理过程,有研究显示某些昆虫miRNA的靶基因是免疫信号通路MAPK中的关键因子,且本实验室已有研究结果显示,二化螟p38 MAPK参与幼虫对Cry1Ca的防御过程。因此,本研究基于Illumina Solexa二代测序技术对经Cry1Ca诱导处理的二化螟中肠miRNA进行测序,注释并分析差异表达miRNA,并根据靶基因预测筛选出可能参与二化螟Cry1Ca防御反应的miRNA,通过对候选miRNA是否参与防御过程的功能研究,最后鉴定可增效生物农药的新靶标。研究结果不仅为解析昆虫对Cry蛋白的防御机制提供新的理论基础和数据支持,同时为增强Bt制剂及转Bt作物对昆虫的毒力、延缓昆虫抗性发展的新技术提供了靶标。主要结果如下:1、Cry1Ca处理组和对照转录组中小RNA分布峰值均为22 nt,被注释的已知小RNA比例都很低,分别为7.2%和7.9%。Cry1Ca处理后,二化螟中肠内miRNA、son RNA、sn RNA、r RNA、pi RNA数量均少于对照。与对照相比,Cry1Ca处理后二化螟中肠内共有358个小RNA表达上调,747个小RNA表达下调;25个差异表达量最高的已知miRNA中,表达量显著上调的miRNA有3个,表达量显著下调的miRNA有22个;而在66个新预测novel miRNA中,23个上调表达,43个下调表达。随机挑选10个miRNA利用q RT-PCR检测不同样品中的表达量,其结果与测序结果一致。2、从差异表达的miRNA中挑选10个候选miRNA,分别沉默和过表达miRNA后,检测二化螟对抗虫水稻T1C-19、T2A-1、TT51的敏感性,结果表明沉默csu-mi R-7322-5p可显著降低二化螟幼虫对TIC-19、TT51的敏感性,过表达csu-mi R-7322-5p可显著增加二化螟幼虫对TIC-19、TT51的敏感性;沉默csu-mi R-3262可显著降低二化螟幼虫对TIC-19的敏感性,过表达csu-mi R-3262可显著增加二化螟幼虫对TT51的敏感性。其它miRNA则未显示与二化螟幼虫敏感性相关。3、基于实验室已有的二化螟基因组序列,使用mi Randa、RNAhybrid、RNA22共同预测得出csu-mi R-7322-5p可与Csp38的3’非编码区结合,最小自由能(Energy)为-25.18 kcal/mol。双荧光素酶报告实验和csu-mi R-7322-5p饲喂实验结果均表明Csp38与csu-miR-7322-5p存在靶标关系,且csu-mi R-7322-5p对Csp38具有转录后调控作用。本研究通过高通量测序、miRNA功能鉴定、miRNA靶基因鉴定等最终筛选得到与二化螟防御Cry杀虫蛋白相关的miRNA。该miRNA可用于生产实践中,从而提高Bt生物农药的毒力,促进Bt生物农药可持续应用,同时为二化螟生物防治策略提供必要的基因资源。

关键词：二化螟 Csp38 MicroRNA Cry1Ca csu-miR-7322-5p

二化螟谷胱甘肽S-转移酶的鉴定分析及其在阿维菌素解毒代谢中的作用研究

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二化螟谷胱甘肽S-转移酶的鉴定分析及其在阿维菌素解毒代谢中的作...

作者：吴赵露扬州大学

学位级别：硕士

二化螟（Chilo suppressalis）是水稻上一种主要的常发性害虫,危害严重时可造成水稻作物严重减产。大环内酯类杀虫剂阿维菌素对昆虫和螨虫具有良好的杀虫活性。有研究发现,二化螟对阿维菌素的抗性水平与试虫中的谷胱甘肽S-转移酶（gluta... 详细信息

二化螟（Chilo suppressalis）是水稻上一种主要的常发性害虫,危害严重时可造成水稻作物严重减产。大环内酯类杀虫剂阿维菌素对昆虫和螨虫具有良好的杀虫活性。有研究发现,二化螟对阿维菌素的抗性水平与试虫中的谷胱甘肽S-转移酶（glutathioneS-transferases,GSTs）活性呈正相关,GSTs可能是导致二化螟对阿维菌素产生抗药性的部分原因。GSTs是生物体中一种主要的解毒酶,能够催化谷胱甘肽和亲电底物结合,增加有毒物质的水溶性,并且能够消除生物体内因受到氧化应激胁迫而产生的活性氧（reactive oxygen species,ROS）,从而减少或避免内源性和外源性有毒物质对生物体造成损害。GSTs也是昆虫Ⅱ相解毒代谢反应的主要代谢酶之一,在昆虫对杀虫剂的解毒代谢及昆虫抗药性的产生中发挥重要作用。本文研究中,基于二化螟转录组和基因组信息,在二化螟中共鉴定到23个CsGSTs基因,包括21个胞质型CsGSTs和2个微粒体型CsGSTs。其中,21个胞质型CsGSTs又可以细分到7个亚家族中,包含3个Delta亚家族基因,5个Epsilon亚家族基因,4个Omega亚家族基因,4个Sigma亚家族基因,1个Theta亚家族基因,2个Zeta亚家族基因和2个Unclassified亚家族基因。对21个胞质型CsGSTs的多重序列比对分析显示,同一亚家族的CsGSTs序列具有较高序列相似性,而不同亚家族的CsGSTs序列同源性则相对较低。大多数胞质型CsGSTs都具有重要的GSH结合位点（G位点）和底物结合位点（H位点）,而在CsGSTe5中没有预测到G位点和H位点,在CsGSTe1、CsGSTe3、CsGSTe4、CsGSTo1-4和CsGSTz1-2中没有发现G位点。此外,Delta类CsGSTs（CsGSTd1-3）具有相同的GSH结合位点,但具有不同的底物结合位点。Sigma类CsGSTs（CsGSTs1-4）具有保守的GSH结合位点,而CsGSTs1与CsGSTs2-4则具有不同的底物结合位点。系统发育分析表明,二化螟CsGSTs与鳞翅目昆虫GSTs具有较高的同源性,不同昆虫的同源基因共聚同一进化枝。对二化螟CsGSTs的基因组结构分析发现,大部分CsGSTs基因包含4-7个外显子。利用RT-qPCR测定了 CsGSTs在二化螟解毒代谢相关组织中的表达量,发现CsGSTs1在幼虫中肠中的表达水平最高,在脂肪体中同样具有很高的表达水平;CsGSTe3和CsGSTo4主要在中肠中表达,CsGSTd2-3和CsGSTs2-3在两种组织中均高表达,而CsGSTe2、CsGSTe4和CsGSTe5在两种组织中的表达量均非常低。杀虫剂增效实验表明,使用马来酸二乙酯（diethylmaleate,DEM）处理二化螟试虫后,二化螟对阿维菌素的敏感性显著增加。使用低剂量0.05 mg/L阿维菌素处理二化螟后,相比于对照组中,CsGSTs酶活性在药剂处理6h后显著提高,在处理12和24 h后没有发生显著变化。此外,测定了 0.05 mg/L阿维菌素处理二化螟6h和24h后CsGSTs基因的表达变化。结果显示,只有CsGSTt1基因在阿维菌素处理6 h后的整虫中上调表达。而在阿维菌素处理24 h后,有16个CsGSTs基因在二化螟整虫中上调表达,其中4个CsGSTs基因（CsGSTe2、CsGSTe4、CsGSTo4和CsGSTu1）在处理试虫的中肠和脂肪体组织中被显著诱导表达。这些结果表明,CsGSTs参与了二化螟对阿维菌素的解毒代谢。为了进一步研究CsGSTs在二化螟对阿维菌素解毒代谢中的作用,本文开展了 CsGSTs的体外表达研究,通过使用大肠杆菌原核表达系统,成功对CsGSTd1、CsGSTe2、CsGSTe4、CsGSTo2、CsGSTs1、CsGSTs3 和 CsGSTu1 共 7 个 CsGSTs蛋白进行重组表达。使用Western Blot对表达的CsGSTs蛋白进行检测,7个重组蛋白的分子量大小均在30 kDa左右。通过对体外表达的7个CsGSTs进行纯化,进一步对它们的酶动力学性质进行测定,结果显示CsGSTs重组蛋白的米氏常数Km 范围在 0.38±0.21-3.01±1.58 mM 之间,Vmax 在 0.10±0.00-0.81±0.52μmol/min/mg之间。对CsGSTs酶活性的抑制实验结果显示,GSTs抑制剂S-己基谷胱甘肽（S-Hexylglutathione,GTx）对CsGSTs重组蛋白具有不同程度的抑制作用,其中GTx对CsGSTs1重组蛋白酶活性的抑制效果最好,抑制中浓度IC50为 0.094 mM,对 CsGSTd1、CsGSTde2、CsGSTe4、CsGSTo2、CsGSTs3 和 CsGSTu1的抑制中浓度介于1.645-4.853 mM。阿维菌素对重组蛋白CsG

关键词：二化螟谷胱甘肽S-转移酶阿维菌素解毒代谢体外表达

二化螟表皮蛋白基因CsLCP16/17和CsLCP17的功能及经皮RNAi的研究

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二化螟表皮蛋白基因CsLCP16/17和CsLCP17的功能及经皮RNAi的研究

作者：刘长鹏扬州大学

学位级别：硕士

二化螟Chilo suppressalis属鳞翅目螟蛾总科草螟科,幼虫蛀食水稻茎部,是我国水稻上的主要害虫之一。昆虫表皮蛋白（cuticular protein,CP）是昆虫表皮的主要组成成分之一,表皮蛋白与几丁质互相交联形成昆虫表皮的主要结构,对昆虫的生长... 详细信息

二化螟Chilo suppressalis属鳞翅目螟蛾总科草螟科,幼虫蛀食水稻茎部,是我国水稻上的主要害虫之一。昆虫表皮蛋白（cuticular protein,CP）是昆虫表皮的主要组成成分之一,表皮蛋白与几丁质互相交联形成昆虫表皮的主要结构,对昆虫的生长发育具有重要的作用。但是鳞翅目昆虫RNA干扰效率低,限制了对其表皮蛋白基因的研究。聚酰胺-胺型树枝状大分子（PAMAM）是一种纳米载体,具有独特的三维结构,其表面是高密度的胺基官能团,具备结合和递送核酸的能力,近年来有研究表明,纳米载体中加入氟链有助于形成“氟相”,通过氟链之间形成的强相互作用链减少纳米载体包裹的药物泄露。本文克隆了二化螟CsLCP16/1 7和CsLCP17基因的全长cDNA序列,并对其分子结构特征进行了分析。本文利用对聚酰胺-胺型树枝状大分子（PAMAM）进行氟化修饰得到的氟化纳米载体P2,在细胞水平建立了针对鳞翅目昆虫Sf9细胞的高效递送系统,活体水平建立了针对二化螟的高效、快捷经皮递送系统,结合RNAi技术建立了针对CsLCP16/17及CsLCP17的高效经皮干扰系统,高效沉默了二化螟CsLCP16/17和CsLCP17基因,系统研究了二化螟表皮蛋白CsLCP1 6/17和CsLCP17的基因功能,具体研究结果如下:（1）利用RT-PCR和RACE技术克隆了二化螟CsLCP16/17和CsLCP17基因的cDNA序列,开放阅读框分别为330 bp和513 bp,编码109和170个氨基酸残基。对两个表皮蛋白氨基酸序列分析显示,CsLCP16/17和CsLCP17都含有保守的几丁质结合结构域Chitin Bind 4,属于CPR家族的RR-1亚家族。多重序列比对分析发现,CsLCP16/17与烟草天蛾MsLCP16/17的氨基酸序列一致性最高,为74.55%,CsLCP17与小菜蛾PxLCP17的氨基酸序列一致性最高,为48.82%。时空表达模式分析显示,CsLCP1 6/17在幼虫期1龄至4龄时期表达量逐渐升高,在4龄幼虫期达到峰值,6龄幼虫期表达量急剧下降,在蛹期和成虫期不表达,CsLCP16/17在表皮中的表达量最高,前肠次之,头部和后肠为低水平表达;CsLCP17在幼虫期1龄至3龄时期表达量逐渐升高,在3龄幼虫期达到峰值后表达量逐步降低,在蛹期和成虫期不表达,CsLCP17在表皮中的表达量最高,头部次之,其他组织中不表达。表明二化螟CsLCP16/17和CsLCP17基因可能对幼虫表皮和头部的生长发育具有重要的作用。（2）琼脂糖凝胶电泳分析发现,当P2与dsRNA电荷量比值（N/P 比）等于或大于1:1时,P2/dsRNA条带被完全阻滞,表明当N/P比等于或大于1:1时,纳米载体P2能够结合并负载dsRNA。通过在Sf9细胞上的转染实验发现,N/P比为32:1和64:1时,纳米载体P2可以负载dsRNA高效地转染Sf9细胞。对Sf9细胞的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein,IAP）基因进行RNA干扰,结果显示,与对照组相比,P2/dsIAP处理组的IAP基因的表达量显著降低,细胞出现凋亡,表明纳米载体P2能够显著提高鳞翅目昆虫细胞的RNA干扰效率。利用荧光显微镜观察发现,纳米载体P2可以携带核酸染料标记的dsRNA穿透二化螟卵块和幼虫体壁进入体内,并且不会影响卵块和幼虫正常的生长发育,表明纳米载体P2能够经皮递送核酸,安全低毒。（3）利用纳米载体P2经皮递送dsLCP1 6/17对二化螟CsLCP16/17进行RNAi,荧光定量PCR检测发现,P2/dsLCP16/17处理组CsLCP16/17基因的表达量显著低于各对照组,干扰效率为80%,表明纳米载体P2经皮递送dsRNA可以有效干扰目的基因,为二化螟的基因功能研究提供了一种高效、快捷的经皮干扰系统。与对照组相比,处理组幼虫钻蛀行为减少甚至不发生钻蛀。用FB 28（荧光增白剂28）将表皮染色后,在显微镜下观察发现,与对照组相比,处理组幼虫气管出现凹陷,凹陷处几丁质不连续、断裂。纳米压痕实验结果显示,处理组幼虫表皮弹性模量是对照组的两倍以上,证明了处理组幼虫表皮硬化程度变高。以上结果表明CsLCP16/17在幼虫表皮和气管的生长发育中起关键性作用。（4）利用纳米载体P2,采用显微注射法对二化螟CsLCP17进行RNAi,荧光定量PCR检测发现,P2/dsLCP17处理组CsLCP17基因的表达量显著低于各对照组,不同时间点的干扰效率在95%以上,基因沉默速度快,持续时间长。处理后72 h发现,处理组幼虫出现头壳发育畸形,蜕皮失败的现象,表明CsLCP17可能参与了二化螟幼虫头部表皮的形成。本文通过结合纳米技术和RNAi技术,开发了经皮递送系统,获得了抑制二化螟生长发育的两种dsRNA,这些研究结果将有助于进一步发展对二化螟表皮的高效绿色RNA农药

关键词：二化螟表皮蛋白纳米载体 RNA干扰

二化螟CsCncC和CsKeap1基因的克隆与mRNA表达分析

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环境昆虫学报 2021年第6期43卷 1504-1514页

作者：季彩宏张楠孟祥坤王建军扬州大学园艺与植物保护学院江苏扬州225009 扬州市职业大学园林园艺学院江苏扬州225009

核因子E2相关因子2(Nrf2)-Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)信号通路可调控抗氧化酶和代谢酶基因的表达,在机体适应氧化和化学胁迫过程中具有重要作用,克隆二化螟Chilo suppressalis CsCncC和CsKeap1基因可为研究二化螟的代谢抗性机... 详细信息

核因子E2相关因子2(Nrf2)-Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)信号通路可调控抗氧化酶和代谢酶基因的表达,在机体适应氧化和化学胁迫过程中具有重要作用,克隆二化螟Chilo suppressalis CsCncC和CsKeap1基因可为研究二化螟的代谢抗性机制奠定基础。本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆了二化螟CsCncC和CsKeap1基因全长cDNA,利用生物信息学方法对其结构特征进行了分析,并利用实时定量PCR检测了基因表达模式。结果表明,CsCncC包含一个长度为2160 bp的开放阅读框,编码719个氨基酸;CsKeap1包含一个长度为1923 bp的开放阅读框,编码640个氨基酸。序列分析发现,CsCncC和CsKeap1都具有保守性结构域和特征性基序。表达分析发现,CsCncC和CsKeap1分别在蛹末期和成虫初期表达水平最高,CsCncC在中肠和马氏管中的表达水平最高,CsKeap1在脂肪体中的表达水平最高。进一步研究发现,在0.47 mg/L氯虫苯甲酰胺处理36 h后,二化螟3龄幼虫的CsCncC和CsKeap1的表达量显著上调,但在0.092 mg/L处理36 h后CsCncC无明显变化,CsKeap1的表达量显著下调,表明诱导效应具有剂量依赖性。本文研究结果表明,CsCncC和CsKeap1参与的信号通路在二化螟适应化学胁迫过程中具有重要作用。

关键词：二化螟 CncC Keap1 氯虫苯甲酰胺基因克隆定量PCR