二化螟谷胱甘肽S-转移酶的鉴定分析及其在阿维菌素解毒代谢中的作用研究

作     者：吴赵露 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孟祥坤

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：二化螟 谷胱甘肽S-转移酶 阿维菌素 解毒代谢 体外表达 

摘      要：二化螟（Chilo suppressalis）是水稻上一种主要的常发性害虫,危害严重时可造成水稻作物严重减产。大环内酯类杀虫剂阿维菌素对昆虫和螨虫具有良好的杀虫活性。有研究发现,二化螟对阿维菌素的抗性水平与试虫中的谷胱甘肽S-转移酶（glutathioneS-transferases,GSTs）活性呈正相关,GSTs可能是导致二化螟对阿维菌素产生抗药性的部分原因。GSTs是生物体中一种主要的解毒酶,能够催化谷胱甘肽和亲电底物结合,增加有毒物质的水溶性,并且能够消除生物体内因受到氧化应激胁迫而产生的活性氧（reactive oxygen species,ROS）,从而减少或避免内源性和外源性有毒物质对生物体造成损害。GSTs也是昆虫Ⅱ相解毒代谢反应的主要代谢酶之一,在昆虫对杀虫剂的解毒代谢及昆虫抗药性的产生中发挥重要作用。本文研究中,基于二化螟转录组和基因组信息,在二化螟中共鉴定到23个CsGSTs基因,包括21个胞质型CsGSTs和2个微粒体型CsGSTs。其中,21个胞质型CsGSTs又可以细分到7个亚家族中,包含3个Delta亚家族基因,5个Epsilon亚家族基因,4个Omega亚家族基因,4个Sigma亚家族基因,1个Theta亚家族基因,2个Zeta亚家族基因和2个Unclassified亚家族基因。对21个胞质型CsGSTs的多重序列比对分析显示,同一亚家族的CsGSTs序列具有较高序列相似性,而不同亚家族的CsGSTs序列同源性则相对较低。大多数胞质型CsGSTs都具有重要的GSH结合位点（G位点）和底物结合位点（H位点）,而在CsGSTe5中没有预测到G位点和H位点,在CsGSTe1、CsGSTe3、CsGSTe4、CsGSTo1-4和CsGSTz1-2中没有发现G位点。此外,Delta类CsGSTs（CsGSTd1-3）具有相同的GSH结合位点,但具有不同的底物结合位点。Sigma类CsGSTs（CsGSTs1-4）具有保守的GSH结合位点,而CsGSTs1与CsGSTs2-4则具有不同的底物结合位点。系统发育分析表明,二化螟CsGSTs与鳞翅目昆虫GSTs具有较高的同源性,不同昆虫的同源基因共聚同一进化枝。对二化螟CsGSTs的基因组结构分析发现,大部分CsGSTs基因包含4-7个外显子。利用RT-qPCR测定了 CsGSTs在二化螟解毒代谢相关组织中的表达量,发现CsGSTs1在幼虫中肠中的表达水平最高,在脂肪体中同样具有很高的表达水平;CsGSTe3和CsGSTo4主要在中肠中表达,CsGSTd2-3和CsGSTs2-3在两种组织中均高表达,而CsGSTe2、CsGSTe4和CsGSTe5在两种组织中的表达量均非常低。杀虫剂增效实验表明,使用马来酸二乙酯（diethylmaleate,DEM）处理二化螟试虫后,二化螟对阿维菌素的敏感性显著增加。使用低剂量0.05 mg/L阿维菌素处理二化螟后,相比于对照组中,CsGSTs酶活性在药剂处理6h后显著提高,在处理12和24 h后没有发生显著变化。此外,测定了 0.05 mg/L阿维菌素处理二化螟6h和24h后CsGSTs基因的表达变化。结果显示,只有CsGSTt1基因在阿维菌素处理6 h后的整虫中上调表达。而在阿维菌素处理24 h后,有16个CsGSTs基因在二化螟整虫中上调表达,其中4个CsGSTs基因（CsGSTe2、CsGSTe4、CsGSTo4和CsGSTu1）在处理试虫的中肠和脂肪体组织中被显著诱导表达。这些结果表明,CsGSTs参与了二化螟对阿维菌素的解毒代谢。为了进一步研究CsGSTs在二化螟对阿维菌素解毒代谢中的作用,本文开展了 CsGSTs的体外表达研究,通过使用大肠杆菌原核表达系统,成功对CsGSTd1、CsGSTe2、CsGSTe4、CsGSTo2、CsGSTs1、CsGSTs3 和 CsGSTu1 共 7 个 CsGSTs蛋白进行重组表达。使用Western Blot对表达的CsGSTs蛋白进行检测,7个重组蛋白的分子量大小均在30 kDa左右。通过对体外表达的7个CsGSTs进行纯化,进一步对它们的酶动力学性质进行测定,结果显示CsGSTs重组蛋白的米氏常数Km 范围在 0.38±0.21-3.01±1.58 mM 之间,Vmax 在 0.10±0.00-0.81±0.52μmol/min/mg之间。对CsGSTs酶活性的抑制实验结果显示,GSTs抑制剂S-己基谷胱甘肽（S-Hexylglutathione,GTx）对CsGSTs重组蛋白具有不同程度的抑制作用,其中GTx对CsGSTs1重组蛋白酶活性的抑制效果最好,抑制中浓度IC50为 0.094 mM,对 CsGSTd1、CsGSTde2、CsGSTe4、CsGSTo2、CsGSTs3 和 CsGSTu1的抑制中浓度介于1.645-4.853 mM。阿维菌素对重组蛋白CsGSTs1的抑制效果呈浓度依赖性变化,在阿维菌素最大检测浓度0.5 mM可抑制CsGSTs147.09±0.11%的酶活性。虽然不同浓度（0.005-0.5 mM）阿维菌素对CsGSTd1、CsGSTde2、CsGSTe4、CsGSTo2、CsGSTs3 和 CsGSTu1 重组蛋白都具有一定的抑制作用,但抑制效果不呈浓度依赖性变化。毒死蜱对CsGSTs酶活性的抑制研究显示,毒死蜱对 CsGSTd1、CsGSTde2、CsGSTe4、CsGSTs1、CsGSTs3 和 CsGSTu1的抑制作用具有剂量依赖性变化,但在0.1-4 mM浓度下的抑制率均低于50%,此外发现毒死蜱对CsGSTs1的抑制作用较弱。利用高效液相色谱（highpressure liquid chromatography,HPLC）检测了 CsGSTs重组蛋白对阿维菌素的体外代谢能力,相比于对照组,CsGSTd1、CsGSTo2、CsGSTe4、CsGSTs1、CsGSTs3 和CsGSTu1处理组中的阿维菌素信号峰面积未发生明显变化。这些结果表明,CsGSTd1、CsGSTe4、CsGSTo2、CsGSTs1、CsGSTs3 和 CsGSTu1 重组蛋白在体外可能不能直接代谢阿维菌素。本文中通过生物信息学技术对二化螟CsGSTs进行鉴定分析,通过增效实验、酶活性测定和基因表达分析研究了 CsGSTs在二化螟对阿维菌素解毒代谢中的作用,进一步通过体外表达、酶动力学测定和体外代谢对CsGSTs的酶学性质和杀虫剂代谢能力进行测定分析。研究结果为揭示GSTs在二化螟及其它昆虫对阿维菌素的解毒代谢中的作用提供研究基础,为昆虫抗药性治理提供帮助。