二化螟防御Cry蛋白过程中相关microRNA的鉴定及应用潜力研究

作     者：李真真 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马伟华

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：二化螟 Csp38 MicroRNA Cry1Ca csu-miR-7322-5p 

摘      要：二化螟(Chilo suppressalis)属鳞翅目害虫,是对我国水稻(Oryza sativa)产业为害最严重的害虫之一。Cry晶体蛋白是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)在孢子形成的过程中产生的杀虫蛋白,在防治二化螟等害虫中发挥巨大的作用。探索昆虫防御Cry杀虫蛋白的调控机制,为在实际生产中更好地利用Cry杀虫蛋白提供新的技术思路。Micro RNA(miRNA)可参与调控生物的许多重要生理过程,有研究显示某些昆虫miRNA的靶基因是免疫信号通路MAPK中的关键因子,且本实验室已有研究结果显示,二化螟p38 MAPK参与幼虫对Cry1Ca的防御过程。因此,本研究基于Illumina Solexa二代测序技术对经Cry1Ca诱导处理的二化螟中肠miRNA进行测序,注释并分析差异表达miRNA,并根据靶基因预测筛选出可能参与二化螟Cry1Ca防御反应的miRNA,通过对候选miRNA是否参与防御过程的功能研究,最后鉴定可增效生物农药的新靶标。研究结果不仅为解析昆虫对Cry蛋白的防御机制提供新的理论基础和数据支持,同时为增强Bt制剂及转Bt作物对昆虫的毒力、延缓昆虫抗性发展的新技术提供了靶标。主要结果如下:1、Cry1Ca处理组和对照转录组中小RNA分布峰值均为22 nt,被注释的已知小RNA比例都很低,分别为7.2%和7.9%。Cry1Ca处理后,二化螟中肠内miRNA、son RNA、sn RNA、r RNA、pi RNA数量均少于对照。与对照相比,Cry1Ca处理后二化螟中肠内共有358个小RNA表达上调,747个小RNA表达下调;25个差异表达量最高的已知miRNA中,表达量显著上调的miRNA有3个,表达量显著下调的miRNA有22个;而在66个新预测novel miRNA中,23个上调表达,43个下调表达。随机挑选10个miRNA利用q RT-PCR检测不同样品中的表达量,其结果与测序结果一致。2、从差异表达的miRNA中挑选10个候选miRNA,分别沉默和过表达miRNA后,检测二化螟对抗虫水稻T1C-19、T2A-1、TT51的敏感性,结果表明沉默csu-mi R-7322-5p可显著降低二化螟幼虫对TIC-19、TT51的敏感性,过表达csu-mi R-7322-5p可显著增加二化螟幼虫对TIC-19、TT51的敏感性;沉默csu-mi R-3262可显著降低二化螟幼虫对TIC-19的敏感性,过表达csu-mi R-3262可显著增加二化螟幼虫对TT51的敏感性。其它miRNA则未显示与二化螟幼虫敏感性相关。3、基于实验室已有的二化螟基因组序列,使用mi Randa、RNAhybrid、RNA22共同预测得出csu-mi R-7322-5p可与Csp38的3’非编码区结合,最小自由能(Energy)为-25.18 kcal/mol。双荧光素酶报告实验和csu-mi R-7322-5p饲喂实验结果均表明Csp38与csu-miR-7322-5p存在靶标关系,且csu-mi R-7322-5p对Csp38具有转录后调控作用。本研究通过高通量测序、miRNA功能鉴定、miRNA靶基因鉴定等最终筛选得到与二化螟防御Cry杀虫蛋白相关的miRNA。该miRNA可用于生产实践中,从而提高Bt生物农药的毒力,促进Bt生物农药可持续应用,同时为二化螟生物防治策略提供必要的基因资源。