二化螟表皮蛋白基因CsLCP16/17和CsLCP17的功能及经皮RNAi的研究

作     者：刘长鹏 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郑洋;徐健

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：二化螟 表皮蛋白 纳米载体 RNA干扰 

摘      要：二化螟Chilo suppressalis属鳞翅目螟蛾总科草螟科,幼虫蛀食水稻茎部,是我国水稻上的主要害虫之一。昆虫表皮蛋白（cuticular protein,CP）是昆虫表皮的主要组成成分之一,表皮蛋白与几丁质互相交联形成昆虫表皮的主要结构,对昆虫的生长发育具有重要的作用。但是鳞翅目昆虫RNA干扰效率低,限制了对其表皮蛋白基因的研究。聚酰胺-胺型树枝状大分子（PAMAM）是一种纳米载体,具有独特的三维结构,其表面是高密度的胺基官能团,具备结合和递送核酸的能力,近年来有研究表明,纳米载体中加入氟链有助于形成“氟相,通过氟链之间形成的强相互作用链减少纳米载体包裹的药物泄露。本文克隆了二化螟CsLCP16/1 7和CsLCP17基因的全长cDNA序列,并对其分子结构特征进行了分析。本文利用对聚酰胺-胺型树枝状大分子（PAMAM）进行氟化修饰得到的氟化纳米载体P2,在细胞水平建立了针对鳞翅目昆虫Sf9细胞的高效递送系统,活体水平建立了针对二化螟的高效、快捷经皮递送系统,结合RNAi技术建立了针对CsLCP16/17及CsLCP17的高效经皮干扰系统,高效沉默了二化螟CsLCP16/17和CsLCP17基因,系统研究了二化螟表皮蛋白CsLCP1 6/17和CsLCP17的基因功能,具体研究结果如下:（1）利用RT-PCR和RACE技术克隆了二化螟CsLCP16/17和CsLCP17基因的cDNA序列,开放阅读框分别为330 bp和513 bp,编码109和170个氨基酸残基。对两个表皮蛋白氨基酸序列分析显示,CsLCP16/17和CsLCP17都含有保守的几丁质结合结构域Chitin Bind 4,属于CPR家族的RR-1亚家族。多重序列比对分析发现,CsLCP16/17与烟草天蛾MsLCP16/17的氨基酸序列一致性最高,为74.55%,CsLCP17与小菜蛾PxLCP17的氨基酸序列一致性最高,为48.82%。时空表达模式分析显示,CsLCP1 6/17在幼虫期1龄至4龄时期表达量逐渐升高,在4龄幼虫期达到峰值,6龄幼虫期表达量急剧下降,在蛹期和成虫期不表达,CsLCP16/17在表皮中的表达量最高,前肠次之,头部和后肠为低水平表达;CsLCP17在幼虫期1龄至3龄时期表达量逐渐升高,在3龄幼虫期达到峰值后表达量逐步降低,在蛹期和成虫期不表达,CsLCP17在表皮中的表达量最高,头部次之,其他组织中不表达。表明二化螟CsLCP16/17和CsLCP17基因可能对幼虫表皮和头部的生长发育具有重要的作用。（2）琼脂糖凝胶电泳分析发现,当P2与dsRNA电荷量比值（N/P 比）等于或大于1:1时,P2/dsRNA条带被完全阻滞,表明当N/P比等于或大于1:1时,纳米载体P2能够结合并负载dsRNA。通过在Sf9细胞上的转染实验发现,N/P比为32:1和64:1时,纳米载体P2可以负载dsRNA高效地转染Sf9细胞。对Sf9细胞的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein,IAP）基因进行RNA干扰,结果显示,与对照组相比,P2/dsIAP处理组的IAP基因的表达量显著降低,细胞出现凋亡,表明纳米载体P2能够显著提高鳞翅目昆虫细胞的RNA干扰效率。利用荧光显微镜观察发现,纳米载体P2可以携带核酸染料标记的dsRNA穿透二化螟卵块和幼虫体壁进入体内,并且不会影响卵块和幼虫正常的生长发育,表明纳米载体P2能够经皮递送核酸,安全低毒。（3）利用纳米载体P2经皮递送dsLCP1 6/17对二化螟CsLCP16/17进行RNAi,荧光定量PCR检测发现,P2/dsLCP16/17处理组CsLCP16/17基因的表达量显著低于各对照组,干扰效率为80%,表明纳米载体P2经皮递送dsRNA可以有效干扰目的基因,为二化螟的基因功能研究提供了一种高效、快捷的经皮干扰系统。与对照组相比,处理组幼虫钻蛀行为减少甚至不发生钻蛀。用FB 28（荧光增白剂28）将表皮染色后,在显微镜下观察发现,与对照组相比,处理组幼虫气管出现凹陷,凹陷处几丁质不连续、断裂。纳米压痕实验结果显示,处理组幼虫表皮弹性模量是对照组的两倍以上,证明了处理组幼虫表皮硬化程度变高。以上结果表明CsLCP16/17在幼虫表皮和气管的生长发育中起关键性作用。（4）利用纳米载体P2,采用显微注射法对二化螟CsLCP17进行RNAi,荧光定量PCR检测发现,P2/dsLCP17处理组CsLCP17基因的表达量显著低于各对照组,不同时间点的干扰效率在95%以上,基因沉默速度快,持续时间长。处理后72 h发现,处理组幼虫出现头壳发育畸形,蜕皮失败的现象,表明CsLCP17可能参与了二化螟幼虫头部表皮的形成。本文通过结合纳米技术和RNAi技术,开发了经皮递送系统,获得了抑制二化螟生长发育的两种dsRNA,这些研究结果将有助于进一步发展对二化螟表皮的高效绿色RNA农药。