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靶向性抗肿瘤VEGF-α-gal融合蛋白的原核表达及其体外活性

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靶向性抗肿瘤VEGF-α-Gal融合蛋白的原核表达及其体外活性

作者：郑毅重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:为了将肺癌的靶向治疗和免疫治疗相结合,本研究扩增了VEGF-α-gal融合基因,构建原核表达质粒pQE30-VEGF-α-gal,在大肠杆菌M15内诱导表达rVEGF-α-gal融合蛋白,并在体外细胞水平上研究重组蛋白的肺癌细胞靶向性和α-gal表位介导的... 详细信息

目的:为了将肺癌的靶向治疗和免疫治疗相结合,本研究扩增了VEGF-α-gal融合基因,构建原核表达质粒pQE30-VEGF-α-gal,在大肠杆菌M15内诱导表达rVEGF-α-gal融合蛋白,并在体外细胞水平上研究重组蛋白的肺癌细胞靶向性和α-gal表位介导的肿瘤细胞杀伤效应,为探索肺癌及其他肿瘤的新型靶向生物治疗途径奠定基础。方法:1.体外培养A549细胞,提取总RNA,以RT-PCR法扩增VEGF-α-gal基因片段作为目的基因,双酶切后定向克隆入pQE30质粒中,构建并鉴定pQE30-VEGF-α-gal原核表达质粒。2.将pQE30-VEGF-α-gal质粒转化进*** M15菌,用IPTG诱导目的蛋白表达,用SDS-PAGE法分析重组蛋白的相对分子质量及表达形式,用Western-blot法分析重组蛋白的抗原性,用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组VEGF-α-gal融合蛋白,然后采取逐步降低尿素浓度的方法使重组蛋白复性。3.通过细胞黏附试验评价重组蛋白中VEGF对肿瘤细胞A549的靶向性,通过血清杀伤试验分析重组蛋白中α-gal模拟表位介导的体外溶肿瘤细胞效应。结果:1.经双酶切鉴定及DNA序列测定,证实pQE30-VEGF-α-gal原核表达质粒构建成功。2.将pQE30-VEGF-α-gal质粒成功转化进*** M15菌,并实现目的蛋白的诱导表达。经SDS-PAGE法分析,目的蛋白分子量为18KDa,主要以包涵体形式为主。Western-blot结果表明,重组蛋白能分别与抗VEGF、抗α-gal特异性结合。纯化的重组蛋白纯度约为90%。3.细胞黏附试验和血清杀伤试验结果证实,纯化复性后的重组蛋白不但能黏附VEGFR+的A549细胞,而且其α-gal模拟表位在人新鲜血清的参与下,对A549细胞产生了明显的溶细胞效应。结论:1.成功构建了原核表达重组质粒pQE30-VEGF-α-gal,并成功表达及纯化了重组VEGF-α-gal融合蛋白,为探索肿瘤生物治疗新途径奠定了基础。2.重组VEGF-α-gal融合蛋白不但具有VEGFR靶向性,还兼具α-gal表位功能,为研究和开发新型靶向肿瘤生物制剂奠定了基础。

关键词：肿瘤靶向性 VEGF α-gal 抗肿瘤活性

猪血细胞表面多糖抗原α-gal与人ABO血型抗原的比较

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徐州医学院学报 2005年第6期25卷 495-498页

作者：曾令宇李幼平李胜富程惊秋徐州医学院附属医院血液科江苏徐州221002 四川大学华西医院移植工程与移植免疫卫生部重点实验室四川成都610041

目的探讨猪血细胞表面多糖抗原α-gal与人ABO血型抗原的相似性。方法人全血A、B、O、AB 4种血型的健康人的新鲜血,肝素抗凝,1 800 r/min离心,取白细胞富集层,利用confocal及流式细胞技术(FCM)检测猪及人ABO 4种血型血细胞与BSI-B4-FITC... 详细信息

目的探讨猪血细胞表面多糖抗原α-gal与人ABO血型抗原的相似性。方法人全血A、B、O、AB 4种血型的健康人的新鲜血,肝素抗凝,1 800 r/min离心,取白细胞富集层,利用confocal及流式细胞技术(FCM)检测猪及人ABO 4种血型血细胞与BSI-B4-FITC结合的情况。结果以A型血细胞为阴性对照,4种血型血小板、RBC、单个核细胞均为阴性,而粒细胞,B型有14%为(+),AB型约有8%为(+),O型约有2%为(+)。结论4种ABO血型抗原中B抗原与α-gal的结构最为相似。

关键词： α-gal 多糖抗原血型抗原

部分α—gal的剔除推动了猪器官移植的发展

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生物技术通报 2003年第1期19卷 44-44页

A comparative study of human and porcine-derived decellularised nerve matrices

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Biomaterials Translational 2023年第3期4卷 180-195页

作者： Rui Li Shuai Qiu Weihong Yang Zilong Rao Jiaxin Chen Yuexiong Yang Qingtang Zhu Xiaolin Liu Ying Bai Daping Quan Guangdong Engineering Technology Research Centre for Functional Biomaterials School of Materials Science and EngineeringSun Yat-sen UniversityGuangzhouGuangdong ProvinceChina Key Laboratory for Polymeric Composite&Functional Materials of Ministry of Education School of ChemistrySun Yat-sen UniversityGuangzhouGuangdong ProvinceChina Guangdong Engineering Technology Research Centre for Peripheral Nerve Tissue Department of Orthopaedic and MicrosurgeryThe First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen UniversityGuangzhouGuangdong ProvinceChina Guangzhou Zhongda Medical Equipment Co. Ltd.GuangzhouGuangdong ProvinceChina

Decellularised extracellular matrix(dECM)biomaterials originating from allogeneic and xenogeneic tissues have been broadly studied in the field of regenerative medicine and have already been used in clinical *** dECMs are considered more compatible,but they have the drawback of extremely limited human tissue *** availability is also restricted by the health and age of the *** investigate the viability of xenogeneic tissues as a substitute for human tissues,we fabricated both porcine decellularised nerve matrix(pDNM)and human decellularised nerve matrix for a comprehensive *** showed that both dECM scaffolds retained the ECM microstructures of native human nerve *** analysis demonstrated that the protein compositions of both dECMs were also very similar to each *** functional ECM contents effectively promoted the proliferation,migration,and maturation of primary human Schwann cells in ***,pDNM contained a few antigens that induced severe host immune responses in humanised ***,after removing theα-galactosidase antigen,the immune responses were highly alleviated and the pre-treated pDNM maintained a human decellularised nerve matrix-like pro-regenerative ***,we believe that anα-galactosidase-free pDNM may serve as a viable substitute for human decellularised nerve matrix in future clinical applications.

关键词： allogeneic decellularised nerve matrix immune response xenogeneic α-gal

α-半乳糖神经酰胺负载DC促进CIK细胞对肝癌细胞的杀伤效应

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中国肿瘤生物治疗杂志 2016年第2期23卷 175-181页

作者：刘红彦张颖王晶波陈莉王惠李栋盖中涛山东大学医学院山东济南250100 山东省千佛山医院重症医学科山东济南250014 济南市传染病医院三科山东济南250021 济南赛尔生物科技有限公司山东济南250101 山东大学齐鲁儿童医院山东济南250022

目的:研究负载α-半乳糖神经酰胺(alpha-galactosylceramide,α-gal Cer)的DC功能与成熟度的改变情况,探讨α-gal Cer-DC与CIK共培养对CIK细胞表型、增殖活性及杀伤肝癌细胞效率的影响。方法:采用密度梯度离心法从人外周血中分离出单个... 详细信息

目的:研究负载α-半乳糖神经酰胺(alpha-galactosylceramide,α-gal Cer)的DC功能与成熟度的改变情况,探讨α-gal Cer-DC与CIK共培养对CIK细胞表型、增殖活性及杀伤肝癌细胞效率的影响。方法:采用密度梯度离心法从人外周血中分离出单个核细胞,悬浮细胞诱导培养CIK细胞,贴壁细胞诱导培养DC;流式细胞仪检测α-gal Cer负载DC的表型,Real-time PCR检测DC相关基因的mRNA表达改变。将α-gal Cer-DC与CIK细胞共培养,流式细胞仪检测DC与CIK细胞表面标志物;锥虫蓝染色法检测CIK细胞的增殖倍数;Real-time PCR检测CIK细胞功能相关基因的表达情况;CCK-8试剂盒检测α-gal Cer-DC对CIK杀伤Hep G2细胞的影响。结果:经过多种细胞因子诱导,可获得CIK细胞和成熟的DC;α-gal Cer负载可促进DC成熟,DC表面标志物CD80、CD86、CD83和CD11c的阳性率均升高(Pα-gal Cer-DC与CIK共培养,可显著提高CIK细胞CD3+CD56+的表达和增殖活性(Pα-gal Cer-DC-CIK细胞对Hep G2细胞的杀伤作用随效靶比的升高而增强,在同一效靶比时α-gal Cer-DC-CIK细胞对靶细胞的杀伤作用最强(Pα-gal Cer负载可促进DC成熟,α-gal Cer-DC与CIK共培养能促进后者增殖和成熟,能显著增强其对肝癌细胞的杀伤活性,为DC-CIK在肿瘤免疫治疗中的应用提供了实验依据。

关键词：树突状细胞细胞因子诱导的杀伤细胞 α-gal Cer 肝癌增殖成熟肿瘤杀伤活性

猪睾丸Sertoli细胞抵御人血清中天然抗体介导的补体杀伤作用

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中华微生物学和免疫学杂志 2009年第2期29卷 137-141页

作者：尹注增王璐胡枫向莹谢林徐婧李俊华陈刚陈实华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究院教育部器官移植重点实验室卫生部器官移植重点实验室武汉430030

目的探讨新生猪睾丸Sertoli细胞抵御人血清中天然抗体介导的补体杀伤作用及其主要机制。方法分离培养10～15日龄的湖北白猪睾丸Sertoli细胞；以猪血管内皮细胞（PED）为对照，采用流式细胞仪（FACS）及免疫荧光检测并比较两种细胞天然... 详细信息

目的探讨新生猪睾丸Sertoli细胞抵御人血清中天然抗体介导的补体杀伤作用及其主要机制。方法分离培养10～15日龄的湖北白猪睾丸Sertoli细胞；以猪血管内皮细胞（PED）为对照，采用流式细胞仪（FACS）及免疫荧光检测并比较两种细胞天然抗原α-gal的表达；FACS检测并比较两种细胞分别与正常人血清（NHS）中天然抗体IgM、IgG的结合情况；乳酸脱氢酶（LDH）检测20％NHS对Sertoli细胞及PED细胞的杀伤；MTT法检测两种细胞在20％NHS中培养的活性；细胞免疫荧光检测补体C3c、C4d在Sertoli细胞、PED细胞的沉积；细胞免疫组化及免疫荧光检测补体C5b-9在两种细胞上的沉积。结果猪睾丸Sertoli细胞表达仪-gal，但明显弱于PED细胞，猪睾丸Sertoli细胞能与天然抗体（主要是IgM）结合；20％NHS对Sertoli细胞、PED细胞的杀伤率分别为24．38％±0．50％、53．13％±14．53％，P〈0．01；两种细胞在20％NHS中的活性分别为98．73％±18．84％、52．43％±8．08％，P〈0．01；免疫荧光及组化可见PED细胞上有补体C3c、CAd、C5b-9的沉积；但Sertoli细胞仅有C3c、CAd沉积，而未见C5b-9沉积。结论猪睾丸Sertoli细胞可以显著抵御人血清中天然抗体介导的杀伤作用，其机制可能与Sertoli细胞低表达仅．gal并抑制补体攻膜复合物形成有关。

关键词： Sertoli细胞 α-gal 补体

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植物多酚对α-半乳糖苷酶提取的影响

食品工业科技 2008年第4期29卷 90-92页

作者：沈汪洋金征宇食品科学与技术国家重点实验室江南大学食品科学与工程学院江苏无锡214122

发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的提取研究中,植物多酚严重的干扰和影响了提取工作。为消除这种干扰,进行了植物多酚的去除研究工作。研究发现:明胶、牛血清白蛋白和聚乙烯聚吡咯烷酮等竞争剂中,1.0%(w/v)PVPP去除植物多酚的效果最好;正丙醇... 详细信息

发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的提取研究中,植物多酚严重的干扰和影响了提取工作。为消除这种干扰,进行了植物多酚的去除研究工作。研究发现:明胶、牛血清白蛋白和聚乙烯聚吡咯烷酮等竞争剂中,1.0%(w/v)PVPP去除植物多酚的效果最好;正丙醇、乙醇、甲醇和丙酮等解析剂中,50%(v/v)丙酮去除植物多酚的效果最好。α-gal提取液经过PVPP和丙酮处理,总酶活达到302nkat,比酶活为19.6nkat/mg。相对于去除植物多酚前的总酶活148nkat,比酶活7.16nkat/mg,提高很多。

关键词： α-gal 植物多酚去除 PVPP 丙酮

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Fabry病的肾脏病变及诊治进展

中国医师进修杂志（内科版） 2006年第6期29卷 8-10页

作者：李文歌卫生部中日友好医院肾病中心北京100029

酵母双杂交技术筛选研究乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP结合蛋白

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传染病信息 2005年第1期18卷 22-22页

作者：陈国凤王琳成军张玲霞李莉张健邵清纪冬解放军军医进修学院北京100853

目的筛选与乙型肝炎病毒DNA聚合酶-N末端蛋白(TP)相互结合的肝细胞蛋白,进一步探讨TP的生物学功能.方法酵母双杂交相关实验材料购自美国Clontech公司,其中pACT2为人肝配合表达的cDNA文库(HumanLiver MATCHMAKER cDNA Library),产品号为*... 详细信息

目的筛选与乙型肝炎病毒DNA聚合酶-N末端蛋白(TP)相互结合的肝细胞蛋白,进一步探讨TP的生物学功能.方法酵母双杂交相关实验材料购自美国Clontech公司,其中pACT2为人肝配合表达的cDNA文库(HumanLiver MATCHMAKER cDNA Library),产品号为***7-53和pGADT7-T中的p53和大T抗原在酵母双杂交试验中相互作用,为阳性对照,pGBKT7-Lam中的Lamin C既不与其他蛋白形成复合物又不与大多数蛋白发生反应,为阴性对照.含有AF384372 HBV DNA P全基因组cDNA的质粒G318A7由解放军第三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心合成并保存.TP基因的上下游引物序列分别为:5'-GAA TTC ATG ATG CCC CTA TCT TAT CAA-3′,5′-GGA TCCTTA CTC TTG TTC CCA AGA ATA-3′,下划线部分为引物两端内切酶EcoRI和BamHI的酶切位点.引物合成及DNA测序由上海博亚公司完成.用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TP片段,连接人酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,用醋酸锂法转入酵母细胞AH109并在其内表达,挑取在SD/-Trp培养基上的转化子-即pGBKT7-TP(AH109)(计数大于1×109个细胞/ml),与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187配合,生长6～18 d后把长出的＞2 mm的酵母集落,在铺有X-α-gal的QDO培养基上检查α-gal活性,蓝色菌落为真阳性集落.挑取阳性集落提取酵母质粒,以复杂冰冻高效感受态方法转化大肠埃希菌,于含有氨苄西林的SOB平板培养,所获得的菌落酶切鉴定后测序.提交GenBank分析.结果成功得到47个与TP特异性结合的阳性克隆,28个克隆与已知基因的部分序列高度同源(96%～100%),含21种目的基因,其余19个克隆基因为假设蛋白(hypothetical pro-tein).筛选出的目的基因包括有:固醇调节元件结合蛋白1;UDP糖基转移酶1家族多肽A9;CD14抗原;β糖蛋白血液结合素;Ⅰ类乙醇脱氢酶γ多肽;WW域结合蛋白2;醛脱氢酶1;延伸因子2;S蛋白基因;补体成分8,α多肽(C8A);唾液酸糖蛋白受体2,转录变异体3;肉毒碱酰基转移酶,转录变异体3;血浆铜蓝蛋白(CP);β激活素E亚基;Z蛋白依赖性蛋白酶抑制剂前体;前列腺特异性膜抗原基因;11号染色体,克隆RP11-107P7;RNA聚合酶Ⅱ亚单位hsRPB7 mRNA;跨膜蛋白4超家族成员2;跨膜蛋白14 A;铁蛋白L链.19个假设蛋白的同源性在97%～100%.结论TP蛋白可以与肝细胞内某些已知和未知功能蛋白相互结合,提示其具有较广泛的生物学功能.

关键词： DNA聚合酶乙型肝炎病毒酵母双杂交技术 TP 筛选聚合酶链反应(PCR) cDNA文库 RNA聚合酶Ⅱ 生物学功能 α-gal 酵母表达载体 CD14抗原唾液酸糖蛋白血浆铜蓝蛋白蛋白酶抑制剂前列腺特异性 11号染色体相互结合酵母细胞