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甘蔗花叶病毒辅助成分-蛋白酶基因原核表达及抗血清制备

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山东农业科学 2019年第3期51卷 87-91页

作者：许小洁于伟鹏杨广玲韩士玲何梦君杨旭李向东山东农业大学植物保护学院植物病毒学研究室山东泰安271018 山东省农业微生物重点实验室山东泰安271018

利用RT-PCR克隆甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV) DWK1分离物辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)基因,酶切后连接原核表达载体pEHISTEV,得到重组质粒pEHISTEV-SCMV-HC-Pro。将重组质粒转化大肠杆菌菌株Rosetta,经IPTG诱导后,表达出57 kD的融合蛋白。切胶回收融合蛋白,多点注射法免疫新西兰长耳兔,制备SCMV HC-Pro抗血清。间接ELISA结果表明,该血清效价为1∶8 192。感染DWK1的玉米叶片病汁液稀释128倍时,该血清仍然能够有效检测出HC-Pro。Western-blot检测结果表明,该血清可特异性检测SCMV第Ⅰ组分离物DWK1和第Ⅳ组分离物DWK2,与同属的烟草脉带花叶病毒(TVBMV)和马铃薯Y病毒(PVY)均无反应。本研究为准确、快速检测SCMV HC-Pro并进一步研究其功能和作用机制奠定了基础。

关键词：甘蔗花叶病毒辅助成分-蛋白酶原核表达抗血清检测

衣壳蛋白参与调控马铃薯Y病毒在珊西烟上症状的关键氨基酸鉴定

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植物病理学报 2023年第5期53卷 870-880页

作者：姬丽云赵平祥闫志勇耿超田延平李向东王凤龙山东农业大学植物保护学院植物病理学系泰安271018 中国农业科学院烟草研究所青岛276101

马铃薯Y病毒(potato virus Y, PVY)可侵染马铃薯和烟草等多种作物,造成严重的经济损失。衣壳蛋白(coat protein, CP)与辅助成分-蛋白酶(helper component proteinase, HC-Pro)互作调控PVY的蚜虫传播,但是否参与PVY在珊西烟上叶脉坏死症... 详细信息

马铃薯Y病毒(potato virus Y, PVY)可侵染马铃薯和烟草等多种作物,造成严重的经济损失。衣壳蛋白(coat protein, CP)与辅助成分-蛋白酶(helper component proteinase, HC-Pro)互作调控PVY的蚜虫传播,但是否参与PVY在珊西烟上叶脉坏死症状的形成还不清楚。本研究分析了前期获得的84个PVY CP突变体在珊西烟上的症状,发现突变体PVY-71和PVY-82不能引起叶脉坏死症状。将CP中保守氨基酸天冬氨酸(D6)和甘氨酸(G9)的密码子分别突变为天冬酰胺(N)和精氨酸(R)的密码子,对应突变体分别命名为pCamPVY-CP^(D6N)和pCamPVY-CP^(G9R),接种珊西烟10 d后,两个突变体均能系统侵染珊西烟,CP积累水平与野生型PVYN605相似,但均不引起叶脉坏死症状。萤火素酶互补试验结果发现,与野生型CP相比,CP突变体与HC-Pro的互作强度减弱。本研究首次为CP参与调控PVY引起的叶脉坏死症状提供了遗传学证据,其D6和G9为关键氨基酸。研究结果对明确CP在PVY侵染过程中的作用,解析PVY坏死症状形成机制具有重要意义。

关键词：马铃薯Y病毒衣壳蛋白叶脉坏死定点突变辅助成分-蛋白酶

番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒突变体的筛选与应用

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植物保护学报 2019年第4期46卷 738-744页

作者：黄显德王玉闫志勇耿超田延平李向东山东农业大学植物保护学院植物病毒研究室泰安271018

为防治番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)在我国葫芦科作物上引起的病毒病害,以PRSV西瓜株系山东分离物(PRSV-SD)侵染性cDNA克隆为基础,采用定点突变方法将辅助成分-蛋白酶保守氨基酸137位和346位的天冬酰胺(N)和417位的缬氨... 详细信息

为防治番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)在我国葫芦科作物上引起的病毒病害,以PRSV西瓜株系山东分离物(PRSV-SD)侵染性cDNA克隆为基础,采用定点突变方法将辅助成分-蛋白酶保守氨基酸137位和346位的天冬酰胺(N)和417位的缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A),应用农杆菌浸润法接种西葫芦叶片并分析突变对PRSV-SD致病力的影响,筛选弱毒突变体,进而评价其交叉保护效果。结果表明,与野生型PRSV-SD相比,获得的3个突变体N137A、N346A和V417A,接种后在西葫芦植株上的症状明显减轻,衣壳蛋白在叶片中的积累水平分别为野生型PRSV-SD的24.0%、13.0%和4.0%,均为弱毒突变体。当保护间隔期为10 d时,弱毒突变体N137A具有完全的交叉保护效果,N346A可延迟发病15 d,而V417A无交叉保护效果。当间隔保护期为15 d时,弱毒突变体N137A和N346A的保护效率分别为100.0%和26.7%,而V417A无交叉保护效果。

关键词：番木瓜环斑病毒辅助成分-蛋白酶弱毒突变体葫芦科作物交叉保护

马铃薯Y病毒HC-Pro第182位赖氨酸残基参与引起烟草叶脉坏死

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植物病理学报 2021年第1期51卷 41-48页

作者：程林发董文浩张凤桐程德杰耿超田延平白艳菊李向东山东农业大学植物保护学院植物病毒学研究室泰安271018 山东省农业微生物重点实验室泰安271018 黑龙江省农业科学院哈尔滨150086

马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是侵染烟草的最重要病毒之一。不同PVY株系侵染烟草可引起不同症状,有些PVY株系可引起烟草叶脉坏死,严重影响烟草的产量和品质。PVY A12分离物属于NTN-NW株系,但侵染珊西烟(Nicotiana tabacum cv. Xant... 详细信息

马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是侵染烟草的最重要病毒之一。不同PVY株系侵染烟草可引起不同症状,有些PVY株系可引起烟草叶脉坏死,严重影响烟草的产量和品质。PVY A12分离物属于NTN-NW株系,但侵染珊西烟(Nicotiana tabacum cv. Xanthi)不能引起叶脉坏死。分析发现,PVY分离物A12 HC-Pro第182和245位的氨基酸均为精氨酸(R),而能引起叶脉坏死的其他NTN-NW分离物HC-Pro的这2个位点均为赖氨酸(K)。PVY坏死株系N605的HC-Pro第182位和245位氨基酸也均为K。本研究通过定点突变,将N605侵染性克隆PVY^(N605)-GFP HC-Pro第245位残基K突变为R,突变体仍然能够引起叶脉坏死,而将其HC-Pro第182位残基K突变为R,突变体不能引起叶脉坏死。Western blot检测发现,2个突变体与野生型病毒CP蛋白在珊西烟中的表达水平没有明显差异。沉默抑制实验结果显示,2个突变体和野生型的HC-Pro抑制RNA沉默能力没有发生变化。初步确定PVY^(N605)-GFP HC-Pro第182残基K是引起叶脉坏死的关键氨基酸,推测PVY A12分离物不能引起烟草叶脉坏死的原因是其HC-Pro第182残基R引起的。

关键词：马铃薯Y病毒辅助成分-蛋白酶叶脉坏死 RNA沉默抑制

甘蔗花叶病毒河南分离物HC-Pro基因的序列分析及其RNA沉默表达载体构建

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河南农业大学学报 2010年第2期44卷 191-195页

作者：夏宗良武轲周朋吴建宇河南农业大学生命科学学院河南郑州450002

采用RT-PCR方法从河南地区甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)感染的玉米叶片中,克隆了辅助成分-蛋白酶基因(helper component-proteinase,HC-Pro).该基因长1 380 bp,编码460个氨基酸.序列比对表明,HC-Pro编码的氨基酸序列与北京、山东地区SCMV分离物的相似性分别达到97%和98%.而与以前数据库登录的河南分离物的相似性仅98%,说明河南地区SCMV可能发生了变异.选取长582 bp的HC-Pro片段,构建了表达发夹RNA的基因沉默双元表达载体pRNAi-HC-Pro(±),成功转化了农杆菌LBA4404.

关键词：甘蔗花叶病毒玉米辅助成分-蛋白酶 RNA干扰

马铃薯Y病毒HC-Pro和甘蔗花叶病毒CP基因的克隆、原核表达与抗血清制备

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马铃薯Y病毒HC-Pro和甘蔗花叶病毒CP基因的克隆、原核表达与抗血...

作者：石鹏君山东农业大学

学位级别：硕士

血清学方法是植物病毒诊断和鉴定病毒的重要方法,在植物病毒的检疫、预测预报、植物病毒的定位、增殖、移动和基因功能等方面研究中也发挥着重大作用。以往用提纯的病毒粒体为抗原制备抗血清存在一些缺陷, 如有些病毒含量非常低、不易提... 详细信息

血清学方法是植物病毒诊断和鉴定病毒的重要方法,在植物病毒的检疫、预测预报、植物病毒的定位、增殖、移动和基因功能等方面研究中也发挥着重大作用。以往用提纯的病毒粒体为抗原制备抗血清存在一些缺陷, 如有些病毒含量非常低、不易提纯,所得抗血清中常含有寄主蛋白的抗体等。通过基因工程技术使病毒的基因在原核细胞中表达, 以表达产物作为抗原制备抗血清, 可以部分解决以上问题。本研究主要结果如下:1 分别以马铃薯 Y 病毒(Potato virus Y, PVY)N 和 O 株系分离物的 RNA 为模板,通过 RT-PCR 克隆到 PVYN、PVYO HC-Pro 基因, 并对其进行了序列分析。测序结果表明两个 HC-Pro 基因全长均为 1368 nt,编码 456 个氨基酸。两个基因的核苷酸同源性为 99.71%, 氨基酸同源性为 99.56%。2 将 PVYN HC-Pro 基因克隆到 pET22b(+)上,构建了原核表达载体 pETHC,使 HC-Pro 基因在大肠杆菌中得到高效表达。用原核表达的 HC-Pro 免疫家兔,获得了 HC-Pro 的抗血清。3 应用 RT-PCR 和特异引物从泰安采集的感染矮花叶病的玉米植株总 RNA 中扩增到一个大约 1 kb 的片段,与克隆载体 pUC18 连接后通过热激法转化大肠杆菌 DH5α。序列测定和结果的表明,泰安地区玉米花叶病由甘蔗花叶病毒(SCMV)引起,该病毒泰安分离物(SCMV-TA)CP 基因含 939 个核苷酸,编码 313 个氨基酸。泰安分离物和国内报道的 SCMV 分离物(特别是山东分离物)有很高的氨基酸序列同源性,而与其它病毒的同源性较低。4 将 SCMV-TA 的外壳蛋白基因克隆到表达载体 pET22b(+),并在大肠杆菌 BL21(DE3)中得到高效表达,表达蛋白约占总蛋白的 15%。用此蛋白制备了效价高、专化性强的抗体。

关键词：马铃薯 Y 病毒辅助成分-蛋白酶甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因克隆原核表达

马铃薯Y病毒弱毒突变体的筛选及其交叉保护作用

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马铃薯Y病毒弱毒突变体的筛选及其交叉保护作用

作者：王振宇山东农业大学

学位级别：硕士

马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)是马铃薯Y病毒科、马铃薯Y病毒属的代表种。PVY寄主范围广泛,可侵染茄科等多种作物,给马铃薯和烟草等作物造成严重经济损失。PVY分离物可分为O株系和N株系,O株系在烟草上引起花叶,N株系可以引起烟草叶... 详细信息

马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)是马铃薯Y病毒科、马铃薯Y病毒属的代表种。PVY寄主范围广泛,可侵染茄科等多种作物,给马铃薯和烟草等作物造成严重经济损失。PVY分离物可分为O株系和N株系,O株系在烟草上引起花叶,N株系可以引起烟草叶脉坏死,对烟叶生产危害更大。本实验通过定点突变分析,获得了含有多位点突变的PVY弱毒突变体,并在其调控与马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)协生的位点引入突变,获得了有应用潜力的弱毒突变体。具体结果如下：1、利用PVYN-605全长cDNA侵染性克隆,构建了四个单位点突变体A(D205G)、 B (N339D)、C(K400R)、D (E419D),接种发现,与野生型PVYN-605相比,症状明显减轻。将这些位点聚合到一起得到的多位点突变体ABC、ABD、ABCD在烟草上不引起叶脉坏死症状,突变体浓度分别降低了25%、38%、47%。2、测定多位点弱毒突变体的交叉保护效果。接种多位点突变体ABC、ABD、 ABCD于普通烟后,在保护间隔期15天、20天时进行挑战接种后没有观察到叶脉坏死症状。ELISA检测病毒的积累量明显低于野生型,约为野生型积累量的30%。这些结果表明突变体ABC、ABD、ABCD具有较好的交叉保护效果。3、明确了调控PVY与PVX协生作用的关键氨基酸。将PVYHC-Pro中的FRNK基序突变为FINK, NRT基序突变为ART后,HC-Pro丧失了抑制RNA沉默的活性。与野生型HC-Pro不同,上述两个突变体插入PVX侵染性克隆pgR106后浸润本氏烟,不引起植株的系统坏死。4、在PVYHC-Pro调控和PVX协生的位点引入突变体ABCD,新获得的突变体对野生型PVY有交叉保护效果,但与PVX无协生作用。

关键词：马铃薯Y病毒辅助成分-蛋白酶弱毒突变体协生作用交叉保护

马铃薯Y病毒分离物A12株系鉴定及致病机理

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马铃薯Y病毒分离物A12株系鉴定及致病机理

作者：张凤桐山东农业大学

学位级别：硕士

马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯上分布最广、危害最大的病毒,对马铃薯生产造成严重损失。准确鉴定PVY的株系类型对马铃薯病毒病的防控具有重要意义。根据与马铃薯抗病基因的识别关系和在烟草上产生的症状可将PVY划分为PVY、PV... 详细信息

马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯上分布最广、危害最大的病毒,对马铃薯生产造成严重损失。准确鉴定PVY的株系类型对马铃薯病毒病的防控具有重要意义。根据与马铃薯抗病基因的识别关系和在烟草上产生的症状可将PVY划分为PVY、PVY、PVY、PVY和PVY株系,其中PVY又可细分为PVY、PVY和PVY株系。本文通过生物学、血清学和分子生物学对采自黑龙江的分离物A12进行了株系鉴定,并对PVY株系分离物A12未引起叶脉坏死的原因进行了分析,主要结果如下:1.证明PVY分离物A12属于NTN-NW株系的SYR-II型ELISA结果表明,A12可被PVY的单克隆抗体特异性识别。A12开放阅读框包含9186个核苷酸,编码3061个氨基酸。一致率分析表明,A12的核苷酸、氨基酸序列与PVY株系分离物SYR-II-Be1一致率最高,分别为98.3%和99.2%。重组分析表明,A12是N-605和O的重组体,重组类型与SYR-II-2-8相同。系统发育分析发现A12聚类到PVY株系SYR-II型的一簇。以上结果表明,A12属于PVY株系的SYR-II型。2.明确了PVY株系分离物A12不能引起烟草叶脉坏死的原因PVY分离物A12属于PVY株系SYR-II型,但与常见PVY株系分离物在珊西烟引起叶脉坏死及花叶的症状所不同,A12仅产生花叶症状。序列比对发现,A12的辅助成分-蛋白酶(HC-Pro)第182位和第245位的氨基酸都是精氨酸(R),而其它PVY株系分离物HC-Pro的第182位和第245位均为赖氨酸(K),因此推测由于第182位和/或第245位氨基酸的突变导致A12不引起叶脉坏中死。通过定点突变技术在PVY605侵染性克隆pCamPVY605-GFP中引入突变获得质粒pCamPVY605-HC和pCamPVY605-HC,这两个质粒编码的HC-Pro第182位和245位氨基酸均由K被突变为R。接种珊西烟后发现,pCamPVY605-HC与pCamPVY605-GFP接种的植株引起的症状相同,都出现叶脉坏死,病毒积累量无明显差异;但pCamPVY605-HC接种的植株只出现花叶症状,病毒积累量也比野生型降低。说明HC-Pro第182位氨基酸由K突变为R导致N605突变体不引起叶脉坏死症状。推测A12不产生叶脉坏死症状是因为HC-Pro第182位氨基酸突变为了精氨酸(R)。与野生型HC-Pro相比,第182位氨基酸突变为精氨酸导致HC-Pro的RNA沉默抑制活性减弱。3.分析了PVY HC-Pro FRNK基序R在症状形成和抑制RNA沉默中的功能通过定点突变技术在PVY605的侵染性克隆pCamPVY605-GFP中引入突变,质粒编码的HC-Pro第180位氨基酸由R被突变为I,接种珊西烟后发现植株未出现叶脉坏死,并且检测不到病毒。随后分析沉默抑制能力的变化,发现与野生型相比pCaPVY-HC浸润部位GFP、mRNA表达水平明显降低。说明在HC-Pro第180位的突变导致PVY辅助成分-蛋白酶的沉默抑制功能丧失,从而影响了致病力。

关键词： PVY 马铃薯辅助成分-蛋白酶株系 RNA沉默抑制