马铃薯Y病毒HC-Pro和甘蔗花叶病毒CP基因的克隆、原核表达与抗血清制备

作     者：石鹏君 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李向东

授予年度：2004年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：马铃薯 Y 病毒 辅助成分-蛋白酶 甘蔗花叶病毒 外壳蛋白基因 克隆 原核表达 

摘      要：血清学方法是植物病毒诊断和鉴定病毒的重要方法,在植物病毒的 检疫、预测预报、植物病毒的定位、增殖、移动和基因功能等方面研究 中也发挥着重大作用。以往用提纯的病毒粒体为抗原制备抗血清存在一 些缺陷, 如有些病毒含量非常低、不易提纯,所得抗血清中常含有寄主 蛋白的抗体等。通过基因工程技术使病毒的基因在原核细胞中表达, 以 表达产物作为抗原制备抗血清, 可以部分解决以上问题。本研究主要结 果如下: 1 分别以马铃薯 Y 病毒(Potato virus Y, PVY)N 和 O 株系分离物的 RNA 为模板,通过 RT-PCR 克隆到 PVYN、PVYO HC-Pro 基因, 并对其进行了序列分析。测序结果表明两个 HC-Pro 基因全长均为 1368 nt,编码 456 个氨基酸。两个基因的核苷酸同源性为 99.71%, 氨基酸同源性为 99.56%。 2 将 PVYN HC-Pro 基因克隆到 pET22b(+)上,构建了原核表达载 体 pETHC,使 HC-Pro 基因在大肠杆菌中得到高效表达。用原核 表达的 HC-Pro 免疫家兔,获得了 HC-Pro 的抗血清。 3 应用 RT-PCR 和特异引物从泰安采集的感染矮花叶病的玉米植株 总 RNA 中扩增到一个大约 1 kb 的片段,与克隆载体 pUC18 连接 后通过热激法转化大肠杆菌 DH5α。序列测定和结果的表明,泰安 地区玉米花叶病由甘蔗花叶病毒(SCMV)引起,该病毒泰安分离 物(SCMV-TA)CP 基因含 939 个核苷酸,编码 313 个氨基酸。泰 安分离物和国内报道的 SCMV 分离物(特别是山东分离物)有很 高的氨基酸序列同源性,而与其它病毒的同源性较低。 4 将 SCMV-TA 的外壳蛋白基因克隆到表达载体 pET22b(+),并在 大肠杆菌 BL21(DE3)中得到高效表达,表达蛋白约占总蛋白的 15%。用此蛋白制备了效价高、专化性强的抗体。