马铃薯Y病毒分离物A12株系鉴定及致病机理

作     者：张凤桐 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李向东

授予年度：2019年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：PVY 马铃薯 辅助成分-蛋白酶 株系 RNA沉默抑制 

摘      要：马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯上分布最广、危害最大的病毒,对马铃薯生产造成严重损失。准确鉴定PVY的株系类型对马铃薯病毒病的防控具有重要意义。根据与马铃薯抗病基因的识别关系和在烟草上产生的症状可将PVY划分为PVY、PVY、PVY、PVY和PVY株系,其中PVY又可细分为PVY、PVY和PVY株系。本文通过生物学、血清学和分子生物学对采自黑龙江的分离物A12进行了株系鉴定,并对PVY株系分离物A12未引起叶脉坏死的原因进行了分析,主要结果如下:1.证明PVY分离物A12属于NTN-NW株系的SYR-II型ELISA结果表明,A12可被PVY的单克隆抗体特异性识别。A12开放阅读框包含9186个核苷酸,编码3061个氨基酸。一致率分析表明,A12的核苷酸、氨基酸序列与PVY株系分离物SYR-II-Be1一致率最高,分别为98.3%和99.2%。重组分析表明,A12是N-605和O的重组体,重组类型与SYR-II-2-8相同。系统发育分析发现A12聚类到PVY株系SYR-II型的一簇。以上结果表明,A12属于PVY株系的SYR-II型。2.明确了PVY株系分离物A12不能引起烟草叶脉坏死的原因PVY分离物A12属于PVY株系SYR-II型,但与常见PVY株系分离物在珊西烟引起叶脉坏死及花叶的症状所不同,A12仅产生花叶症状。序列比对发现,A12的辅助成分-蛋白酶(HC-Pro)第182位和第245位的氨基酸都是精氨酸(R),而其它PVY株系分离物HC-Pro的第182位和第245位均为赖氨酸(K),因此推测由于第182位和/或第245位氨基酸的突变导致A12不引起叶脉坏中死。通过定点突变技术在PVY605侵染性克隆pCamPVY605-GFP中引入突变获得质粒pCamPVY605-HC和pCamPVY605-HC,这两个质粒编码的HC-Pro第182位和245位氨基酸均由K被突变为R。接种珊西烟后发现,pCamPVY605-HC与pCamPVY605-GFP接种的植株引起的症状相同,都出现叶脉坏死,病毒积累量无明显差异;但pCamPVY605-HC接种的植株只出现花叶症状,病毒积累量也比野生型降低。说明HC-Pro第182位氨基酸由K突变为R导致N605突变体不引起叶脉坏死症状。推测A12不产生叶脉坏死症状是因为HC-Pro第182位氨基酸突变为了精氨酸(R)。与野生型HC-Pro相比,第182位氨基酸突变为精氨酸导致HC-Pro的RNA沉默抑制活性减弱。3.分析了PVY HC-Pro FRNK基序R在症状形成和抑制RNA沉默中的功能通过定点突变技术在PVY605的侵染性克隆pCamPVY605-GFP中引入突变,质粒编码的HC-Pro第180位氨基酸由R被突变为I,接种珊西烟后发现植株未出现叶脉坏死,并且检测不到病毒。随后分析沉默抑制能力的变化,发现与野生型相比pCaPVY-HC浸润部位GFP、mRNA表达水平明显降低。说明在HC-Pro第180位的突变导致PVY辅助成分-蛋白酶的沉默抑制功能丧失,从而影响了致病力。