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表达IL-7和CCL19的溶瘤痘苗病毒的构建及其靶向治疗肝癌的研究

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表达IL-7和CCL19的溶瘤痘苗病毒的构建及其靶向治疗肝癌的研究

作者：张蕾蕾浙江理工大学

学位级别：硕士

痘苗病毒是肿瘤靶向基因-病毒疗法常用的病毒载体。利用痘苗病毒为载体装载肿瘤治疗基因的靶向基因-病毒疗法结合基因治疗和病毒治疗的优点,既提高了肿瘤治疗的疗效又增加了靶向性,是理想的肿瘤治疗方案。免疫因子IL-7和CCL19是趋化因... 详细信息

痘苗病毒是肿瘤靶向基因-病毒疗法常用的病毒载体。利用痘苗病毒为载体装载肿瘤治疗基因的靶向基因-病毒疗法结合基因治疗和病毒治疗的优点,既提高了肿瘤治疗的疗效又增加了靶向性,是理想的肿瘤治疗方案。免疫因子IL-7和CCL19是趋化因子家族成员,与其受体结合后IL-7/IL-7R和CCL19/CCR7能促进T细胞的生存和增殖,增加DC、CD8+T细胞等的肿瘤浸润,显示出良好的抗肿瘤免疫作用。利用肿瘤靶向基因-病毒策略携带免疫因子,将基因治疗、病毒疗法和免疫治疗相结合,提高治疗效果和靶向性的同时将副作用降到最低,能为肿瘤治疗提供了新的策略。本论文以溶瘤痘苗病毒(Western Reserve株)为载体,利用基因工程方法构建了分别携带IL-7、CCL19和双基因IL-7-F2A-CCL19的重组病毒vv-IL-7、vv-CCL19和vv-IL-7-F2A-CCL19。在体外研究中,用qPCR、Western blot和ELISA方法证明病毒感染肿瘤细胞后IL-7和CCL19显著高表达;TCID50法证明插入IL-7和CCL19基因不影响病毒在肿瘤细胞中的正常复制;用MTT和结晶紫染色证明病毒对肿瘤细胞有显著的细胞毒性。在体内研究中,构建PBMC/MHCC-97H荷瘤肝癌裸鼠模型和鼠源肝癌细胞Hepa1-6荷瘤c57bl/6小鼠模型,以探究病毒对肿瘤生长的抑制效果和小鼠体内免疫反应。结果表明重组治疗病毒对PBMC/MHCC-97H荷瘤裸鼠模型肿瘤生长有显著抑制作用,但是双基因病毒vv-IL-7-F2A-CCL19和单基因病毒vv-IL-7、vv-CCL19间无显著差异;在c57bl/6鼠源肝癌小鼠模型中病毒处理组出现小鼠肿瘤完全消退现象,远端肿瘤生长也明显受到抑制。肿瘤组织和小鼠脾脏免疫细胞流式分型结果表明在荷瘤裸鼠模型脾脏中CD8+T细胞、CD4+T细胞和Treg细胞占淋巴细胞的比例并未显著升高,在c57bl/6小鼠模型病毒处理组肿瘤和脾脏中CD8+T细胞、CD4+T细胞和Treg细胞占淋巴细胞比例显著上升,抗肿瘤免疫反应被激活和增强。综上,我们构建了表达趋化因子IL-7和CCL19的新型溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19和vv-IL-7-F2A-CCL19,证明了病毒在体内和体外能够有效杀伤肿瘤细胞,在体内还能够发挥溶瘤作用和增强抗肿瘤免疫反应,为溶瘤病毒疗法与免疫治疗相结合的癌症靶向治疗提供了新思路。

关键词：溶瘤痘苗病毒白细胞介素7 CC基序趋化因子19 消化道肿瘤免疫治疗

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IL-7直核表达载体的构建及稳定表达

IL-7直核表达载体的构建及稳定表达

作者：徐雷西北民族大学

学位级别：硕士

白细胞介素7 (Interleukin-7, IL-7),简称白介素7,是由胸腺基质细胞产生的一种细胞因子,成纤维、胎儿肝、骨髓基质等细胞也均可产生或分泌,在T细胞的生长、存活及分化过程中起着至关重要的作用,且与癌症、HIV、白血病等许多恶性疾病的... 详细信息

白细胞介素7 (Interleukin-7, IL-7),简称白介素7,是由胸腺基质细胞产生的一种细胞因子,成纤维、胎儿肝、骨髓基质等细胞也均可产生或分泌,在T细胞的生长、存活及分化过程中起着至关重要的作用,且与癌症、HIV、白血病等许多恶性疾病的发生、发展和治疗有着密切的关系,是一种具有广泛应用前景的新型治疗药物。本研究通过建立IL-7的真核表达细胞系,实现了其在哺乳动物细胞中的分泌表达,为开发基因工程IL-7及相关研究奠定了坚实的基础。参照NCBI数据库中IL-7的核苷酸序列,分别构建了pLV-CMV-EF1-GP-IL7与pcDNA3.1-IL7两种表达载体,并分别在CHO-K1与HEK293细胞中表达。将慢病毒表达载体pLV-CMV-EF1-GP-IL7与包装质粒VSVG、PLP、PLP1及PLP2共转染HEK-293T细胞,制备基因重组人IL-7慢病毒,病毒的滴度可达3.0×108 (TU/mL)。感染CHO-K1与HEK293细胞后,通过观察细胞的荧光数量来判断细胞的感染效率,可分泌表达IL-7蛋白,培养48h的CHO-K1-IL7与HEK293-IL7细胞上清中IL-7的含量分别为0.6ng/mL和0.893 ng/mL。将pcDNA3.1-IL7载体与对照组载体pcDNA3.1-EGFP分别转染CHO-K1与HEK293细胞,通过观察对照组细胞的荧光数量判断实验组细胞的转染效率,并进行细胞克隆,共获取2株表达量较高的细胞株,分别命名为CHO-K1-IL7-1E4与HEK293-IL7-2G3细胞,也为分泌型表达,培养48h的细胞上清中IL-7的含量分别为0.743ng/mL和3.2ng/mL。本研究中IL-7蛋白为分泌型表达,最高表达量为3.2ng/mL,但蛋白表达量相对较低,需对实验方法及细胞培养条件进一步优化,提高IL-7蛋白的表达水平。

关键词：白细胞介素7 慢病毒转染表达

干扰素-α对Behcet病患者外周血中白介素-17表达的影响

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中华眼底病杂志 2012年第6期28卷 627-629页

作者：柳小丽杨培增苏冠方王朝奎肖骏吉林大学第二医院眼科长春130000 重庆医科大学附属第一医院眼科

研究表明，白介素（IL）-17通路和Th17细胞在Behcet病发生中有重要作用口“。干扰素（IFN）-a可控制Behcet病活动性炎症，减少复发次数阻“。但目前有关其具体作用机制还不完全清楚。

关键词：贝赫切特综合征药物疗法干扰素a 药物作用白细胞介素7 代谢 CD4阳性T 淋巴细胞

hIL7-SA与mIL21-SA双功能融合蛋白联合锚定治疗表浅膀胱癌的实验研究

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hIL7-SA与mIL21-SA双功能融合蛋白联合锚定治疗表浅膀胱癌的实验...

作者：王菲南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景世界范围内,膀胱癌位列男性最常见实体瘤的第四位,在女性位列第七位,每年新诊断的膀胱癌患者超过350000名。在我国,膀胱癌目前仍是最常见的泌尿系统恶性肿瘤,在泌尿系统肿瘤11,其发病率和死亡率均居首位。近几年我国部分城市... 详细信息

研究背景世界范围内,膀胱癌位列男性最常见实体瘤的第四位,在女性位列第七位,每年新诊断的膀胱癌患者超过350000名。在我国,膀胱癌目前仍是最常见的泌尿系统恶性肿瘤,在泌尿系统肿瘤11,其发病率和死亡率均居首位。近几年我国部分城市膀胱癌的发病率呈现稳中有升的趋势。国内大城市中如北京,上海,天津,膀胱癌的发病率已位列男性常见恶性肿瘤的第六位,而死亡率位列第七位。膀胱癌90%以上的患者为移行细胞癌(transition cell carcinoma of the bladder TCC),其中约75%为表浅膀胱癌(superficial bladder cancer SBC),即局限于膀胱粘膜固有层的膀胱肿瘤。目前的主要治疗方法是经尿道膀胱肿瘤切除术(transurethral resection of bladder tumor TCRBT),2/3病例会在术后5年内复发,并出现肿瘤分期的进展,因此术后常规辅以膀胱灌注治疗来预防复发。目前,灌注药物多采用化学药物丝裂霉素(MMC)、表柔吡星(ADM)等,膀胱灌注化疗虽然在表浅膀胱癌的术后治疗中起到了重要作用,但由于部分肿瘤出现化疗耐药性及对化疗药物的不敏感,对于此类肿瘤,探寻新的治疗方法是研究的重点。生物治疗即通过借助生物制剂的作用调动机体的防御机制,以调节机体的生物学反应,从而抑制或阻止肿瘤生长成为第四种疗法。而生物免疫制剂卡介苗(BCG)在临床研究表明仍有30%-40%无应答,在治疗有效的病例中,其副作用又进一步制约了其更为广泛的应用。因此,寻找其它免疫制剂在预防肿瘤的复发,已成为人们关注的重点。近年来大量的临床研究证明,干扰素(IFN-α、FN-γ)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF-a)、白细胞介素2(IL2)等进行膀胱灌注治疗,取得了一定的效果。但是,这些细胞因子在体内常因半衰期短,病灶周围有效浓度难以长时间维持,而降低了其抗肿瘤效果。本研究所利用了一种新的蛋白质锚定技术,该技术的主要原理为：充分利用了细胞表面蛋白质的氨基易生物素化以及生物素与链亲和素高效而强有力几乎不可逆的结合这两个特性。利用这个蛋白质锚定技术平台,可在表浅膀胱癌细胞进行快速表面修饰,使免疫刺激因子迅速地锚定在细胞的表面、并能使这些已锚定的细胞因子仍保持其生物活性,延缓其代谢的速度,提高肿瘤局部组织中细胞因子浓度,刺激机体的抗肿瘤免疫反应。白细胞介素7(IL-7)于1988年发现,由骨髓基质细胞产生,靶细胞主要为淋巴细胞,对B祖细胞、胸腺细胞及外周成熟T细胞等,均有促生长活性,并调节淋巴细胞和巨噬细胞的分化、增殖、活化。主要生物学功能包括促进前B细胞的增殖,刺激活化T细胞增殖,调节胸腺DN细胞的分化,诱导巨噬细胞成熟,促进CTL和LAK增殖,分化并增强其杀伤活性。在骨髓移植后给予IL-7和干细胞因子(stem cell factor, SCF)的联合治疗,能加速骨髓来源的淋巴祖细胞再生和免疫功能的恢复。多项研究证实,IL-7具有抗肿瘤作用。白细胞介素21(IL-21)于2000年发现,属于IL-2超家族,主要由活化的CD4+T细胞分泌,调节B细胞、T细胞、NK细胞和树突状细胞的增殖和分化。主要生物学功能包括在抗CD3单克隆抗体协同刺激下促进T细胞的增殖分化,刺激NK细胞的增殖分化,通过增强IgG抗体应答反应、抑制IgE合成来调节正常的体液免疫,通过调节CD8+T细胞和NK细胞的活性清除肿瘤细胞。研究表明,IL-21在抗肿瘤过程中,增加肿瘤侵润CD8+T细胞的数量,提高肿瘤特异性CD8+T细胞的数量,保护个体再次接受同种肿瘤的攻击。本研究将hIL7-SA与mIL21-SA双功能融合蛋白联合锚定治疗小鼠表浅膀胱癌,探求其治疗表浅膀胱癌和预防表浅膀胱癌的疗效,尤其是IL-7和IL-21联合锚定是否有协同效应。本研究分为两部分开展：第一部分：hIL7-SA与mIL21-SA双功能融合蛋白的表达、纯化、复性及鉴定 1、研究目的制备hIL7-SA与mIL21-SA双功能融合蛋白,并在体外研究两者生物学活性。 2、研究方法 1)将原核表达载体hIL7-SA-pET24a重组质粒(本室构建)转化入BL21(DE3)感受态细胞。筛选出最佳诱导条件(表达时间、最适温度等)。大量扩菌,收集菌体,超声破菌,提取包涵体,镍金属螯合层析柱(Ni-NTA)分离纯化,梯度法复性。同样的原理,制备mIL21-SA双功能融合蛋白。 2)MTT法分别检测hIL7-SA、mIL21-SA融合蛋白对小鼠胸腺细胞的增殖。流式细胞仪分别分析hIL7-SA、mIL21-SA融合蛋白对生物素化后的MB49细胞锚定修饰率及同时锚定后的修饰率。锚定修饰后再次进行活性测定,检测锚定后hIL7-SA、mIL21

关键词：白细胞介素7 白细胞介素21 融合蛋白链亲合素锚定表浅膀胱癌

表达鼠源IL-7的重组狂犬病病毒样囊泡安全性和免疫原性研究

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表达鼠源IL-7的重组狂犬病病毒样囊泡安全性和免疫原性研究

作者：林楚晗华中农业大学

学位级别：硕士

狂犬病(Rabies virus,RABV)作为最古老的传染病之一,是由狂犬病病毒引起的几乎能感染所有哺乳动物的人畜共患病,其病死率几乎为100%,每年在世界范围导致约59,000人死亡,且绝大多数病例出现于发展中国家。疫苗接种是当前狂犬病防控的最... 详细信息

狂犬病(Rabies virus,RABV)作为最古老的传染病之一,是由狂犬病病毒引起的几乎能感染所有哺乳动物的人畜共患病,其病死率几乎为100%,每年在世界范围导致约59,000人死亡,且绝大多数病例出现于发展中国家。疫苗接种是当前狂犬病防控的最有效手段,但目前应用的狂犬疫苗的免疫原性不高且免疫程序复杂,因此研制安全、高效的狂犬病新型疫苗对狂犬病的防控意义重大。狂犬病病毒样囊泡是一种由赛姆利基森林病毒的RNA复制子与狂犬病病毒糖蛋白共同组成的载体,能够诱导小鼠产生与狂犬病弱毒疫苗相当的针对狂犬病毒的特异性免疫反应。我们前期研究发现,白细胞介素7(Interleukin 7,IL-7)作为佐剂可以提高狂犬病弱毒疫苗的免疫原性,并降低致病性。因此,本研究在狂犬病病毒样囊泡的基础上,拟构建表达鼠源IL-7的重组狂犬病病毒样囊泡,并对其安全性和免疫原性开展研究,主要取得如下结果:我们首先通过反向遗传操作技术拯救表达增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,e GFP)的重组狂犬病病毒样囊泡,命名为rVLVs-e GFP-OptiG,通过荧光显微镜直接观察及间接免疫荧光的方法验证了外源蛋白e GFP可以被高效表达,且e GFP基因的插入不影响病毒样囊泡的遗传稳定性,这表明通过反向遗传操作技术表达外源蛋白的策略是可行性。在上述载体的基础上,我们进一步构建了表达鼠源IL-7的重组狂犬病病毒样囊泡,并通过IFA鉴定了该重组病毒样囊泡已成功拯救,命名为rVLVs-mIL7-OptiG。同时,利用ELISA测得IL-7在rVLVs-mIL7-OptiG感染的BHK-21细胞中可以被成功表达并呈现剂量依赖性。细胞活性试验结果表明IL-7的表达不影响感染细胞的活性;生长曲线的测定结果表明,IL-7基因的插入不影响病毒样囊泡的体外增殖,且rVLVs-mIL7-OptiG经过10次连续传代后可以检测到IL-7基因以及IL-7的表达,表明该病毒样囊泡具有稳定遗传的特性。我们进一步对rVLVs-mIL7-OptiG的致病性和免疫原性进行了研究。我们将rVLVsmIL7-OptiG和rVLVs-e GFP-OptiG分别采用脑内注射途径感染成年小鼠和乳鼠,通过监测感染小鼠的生存情况、体重变化以及脑内的病毒载量,发现rVLVs-mIL7-OptiG感染后限制了病毒在脑内的增殖,从而提高重组狂犬病病毒样囊泡的安全性。在免疫原性研究中,我们发现rVLVs-mIL7-OptiG免疫小鼠后诱导的中和抗体水平与rVLVs-eGFPOptiG相当。综上所述,本研究成功构建并拯救了表达鼠源IL-7的重组狂犬病病毒样囊泡rVLVsmIL7-OptiG,其在小鼠模型中诱导的抗体水平与rVLVs-e GFP-OptiG所诱导的相当,且具有更高的安全性,为安全、高效的狂犬病新型疫苗的研究提供新的思路。

关键词：狂犬病疫苗甲病毒载体病毒样囊泡白细胞介素7 安全性

CD4^＋CD25^＋CD127^dim/-调节性T淋巴细胞对肝星状细胞增殖及功能的影响

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中华传染病杂志 2011年第9期39卷 529-533页

作者：陈永平程瑗金晓芝阳韬王春莹刘俊郑明华温州医学院附属第一医院感染科 325000

目的了解CD4^＋CD25^＋CD127^dim/-调节性T淋巴细胞在体外对肝星状细胞（HSC）增殖以及功能的影响，初步探讨调节性T淋巴细胞促肝纤维化的机制。方法传代培养HSC LX-2，将免疫磁珠细胞分选（MASC）法分离所得慢性乙型肝炎患者调节性T淋... 详细信息

目的了解CD4^＋CD25^＋CD127^dim/-调节性T淋巴细胞在体外对肝星状细胞（HSC）增殖以及功能的影响，初步探讨调节性T淋巴细胞促肝纤维化的机制。方法传代培养HSC LX-2，将免疫磁珠细胞分选（MASC）法分离所得慢性乙型肝炎患者调节性T淋巴细胞与HSC LX-2按不同方式共培养5d，以单独培养的HSC作为对照，细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测共培养HSC增殖情况，ELISA法检测上清液中转化生长因子（TGF）β1含量，放射免疫法检测HSC分泌HA、PCⅢ水平。统计学处理采用LSD-t检验。结果5例调节性T淋巴细胞与HSC比例为1．5：1时HSC增殖最为明显，10例直接接触共培养与使用Transwell系统共培养调节性T淋巴细胞与HSC吸光度值分别为（0．713±0．032）、（0．735±0．028）cpm，均较对照组的（0．677±0．029）cpm增殖明显（t=5．4003，8．7878；均P〈0．01）。10例直接接触共培养与Transwell组细胞上清液中TGFCβ1浓度分别为（781．59±76．45）、（813．53±60．62）pg／mL，显著高于对照组的（722．51±59．66）pg／mL（t=4．0014，6．1653；均P〈0．01）；HA浓度分别为（433．57±27．90）、（445．40±23．73）ng／mL，显著高于对照组的（415．83±19．44）ng／mL（t=3．3124，5．5231；均P〈0．01）；PCⅢ浓度分别为（21．93±1．71）、（23．12±1．87）ng／mL，显著高于对照组的（20．10±1．49）ng／mL（t=4．8082，7．9436；均P〈0．01）。且Transwell组各项结果均显著高于直接接触组（t=3．3875，2．1639，2．2107，3．1354；均P〈0．05）。结论CD4^＋CD25^＋CD127^dim/-调节性T淋巴细胞可促进共培养的HSC增殖及其HA、pCⅢ的分泌。体外实验证明，CD4^＋CD25^＋CD127^dim/-调节性T淋巴细胞具有促进肝纤维化的重要作用。

关键词： CD4阳性T淋巴细胞受体白细胞介素7 白细胞介素2受体α亚单位肝硬化星形细胞细胞培养的转化生长因子β1

IL-7与IL-2、PHA或抗CD3联用诱导人外周血LAK细胞的研究

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上海免疫学杂志 2002年第1期22卷 61-61,29页

作者：叶萍程一櫂王艳钱振超大连市红十字血液中心大连116011 大连医科大学大连116027

PHA-LAK细胞和CD3AK细胞的活性均优于IL-2培养的常规LAK细胞~[1,2]。本文分析比较IL-7对PHA-LAK、CD3AK细胞诱导和活性的影响。

关键词：白细胞介素7 白细胞介素2 PHA CD3 肿瘤外周血 LAK细胞研究免疫疗法

急性冠脉综合征患者血清IL-7的表达水平及其对预后的影响（英文）

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心血管康复医学杂志 2014年第6期23卷 597-600页

作者：周代星王定淼占成业严丽钟强李树生华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊科湖北武汉430030 咸宁市中心医院同济咸宁医院急诊科

目的：探讨急性冠脉综合征（ACS）患者血清白细胞介素（IL）-7表达水平并分析其与预后的关系.方法：选择ACS患者130例（急性心肌梗死70例,不稳定型心绞痛60例）、稳定型心绞痛患者33例（SAP组）、健康体检者89例（健康对照组）,使用ELIS... 详细信息

目的：探讨急性冠脉综合征（ACS）患者血清白细胞介素（IL）-7表达水平并分析其与预后的关系.方法：选择ACS患者130例（急性心肌梗死70例,不稳定型心绞痛60例）、稳定型心绞痛患者33例（SAP组）、健康体检者89例（健康对照组）,使用ELISA法检测各组IL-7水平并进行比较,并跟踪随访130例ACS患者的病情,通过Logistic回归分析判断IL-7水平与预后的关系.结果：与健康对照组和SAP组比较,UAP组和AMI组IL-7水平均显著升高[（1.84±0.47） pg/ml、（2.11±0.63） pg/ml比（4.87±0.52） pg/ml、（5.15±0.71） pg/ml,P＜0.05或P＜0.01],健康对照组与SAP组,UAP组与AMI组之间IL-7水平无显著差异（P均＞0.05）;Logistic回归分析显示,ACS患者血清中IL-7的水平是发生不良心血管事件的独立危险因素（OR=1.212,95％CI：1.061～1.418）.结论：白细胞介素-7作为机体重要的炎症因子之一,其水平在急性冠脉综合征患者的异常升高,可能具有判断疾病预后的重要价值.

关键词：急性冠状动脉综合征白细胞介素7 预后

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冠心病患者外周血IL-7的检测及临床意义

中国心血管病研究 2006年第7期4卷 487-489页

作者：郑慧萍王燕妮马爱群杨碧波北京大学第三医院心脏外科北京市100083 西安交通大学第一临床医院

目的观察急性冠脉综合征患者血循环中IL-7的含量、来源及其在急性冠脉综合征中的作用。方法临床确诊为冠心病的患者75例,健康志愿者17名,测血浆及血清中IL-7含量;应用二磷酸腺苷诱导活化血小板,采用ELISA法测定活化前后血浆中IL-7的含... 详细信息

目的观察急性冠脉综合征患者血循环中IL-7的含量、来源及其在急性冠脉综合征中的作用。方法临床确诊为冠心病的患者75例,健康志愿者17名,测血浆及血清中IL-7含量;应用二磷酸腺苷诱导活化血小板,采用ELISA法测定活化前后血浆中IL-7的含量。结果急性冠脉综合征患者血浆IL-7浓度明显高于稳定型心绞痛患者和对照者;血小板活化后血浆中IL-7的含量明显增加。结论IL-7为冠心病一种新的生物学标志;循环中增加的IL-7主要来自血小板,IL-7参与血小板依赖的血栓形成过程,标志冠心病临床不稳定性发展。

关键词：白细胞介素7 冠状动脉疾病血小板活化