IL-7直核表达载体的构建及稳定表达

作     者：徐雷 

作者单位：西北民族大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马忠仁

授予年度：2016年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：白细胞介素7 慢病毒 转染 表达 

摘      要：白细胞介素7 (Interleukin-7, IL-7),简称白介素7,是由胸腺基质细胞产生的一种细胞因子,成纤维、胎儿肝、骨髓基质等细胞也均可产生或分泌,在T细胞的生长、存活及分化过程中起着至关重要的作用,且与癌症、HIV、白血病等许多恶性疾病的发生、发展和治疗有着密切的关系,是一种具有广泛应用前景的新型治疗药物。本研究通过建立IL-7的真核表达细胞系,实现了其在哺乳动物细胞中的分泌表达,为开发基因工程IL-7及相关研究奠定了坚实的基础。参照NCBI数据库中IL-7的核苷酸序列,分别构建了pLV-CMV-EF1-GP-IL7与pcDNA3.1-IL7两种表达载体,并分别在CHO-K1与HEK293细胞中表达。将慢病毒表达载体pLV-CMV-EF1-GP-IL7与包装质粒VSVG、PLP、PLP1及PLP2共转染HEK-293T细胞,制备基因重组人IL-7慢病毒,病毒的滴度可达3.0×108 (TU/mL)。感染CHO-K1与HEK293细胞后,通过观察细胞的荧光数量来判断细胞的感染效率,可分泌表达IL-7蛋白,培养48h的CHO-K1-IL7与HEK293-IL7细胞上清中IL-7的含量分别为0.6ng/mL和0.893 ng/mL。将pcDNA3.1-IL7载体与对照组载体pcDNA3.1-EGFP分别转染CHO-K1与HEK293细胞,通过观察对照组细胞的荧光数量判断实验组细胞的转染效率,并进行细胞克隆,共获取2株表达量较高的细胞株,分别命名为CHO-K1-IL7-1E4与HEK293-IL7-2G3细胞,也为分泌型表达,培养48h的细胞上清中IL-7的含量分别为0.743ng/mL和3.2ng/mL。本研究中IL-7蛋白为分泌型表达,最高表达量为3.2ng/mL,但蛋白表达量相对较低,需对实验方法及细胞培养条件进一步优化,提高IL-7蛋白的表达水平。