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基于SCAR标记的小麦禾谷孢囊线虫快速分子检测技术

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中国农业科学 2012年第21期45卷 4388-4395页

作者：亓晓莉彭德良彭焕龙海波黄文坤贺文婷中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室

【目的】建立从禾谷孢囊线虫及其近缘种的混合群体中检测禾谷孢囊线虫的快速分子检测方法。【方法】使用随机扩增多态性DNA(RAPD)和特征序列扩增区域(SCAR)标记的方法,运用PCR技术进行特异性检测。【结果】用本研究建立的SCAR标记快速... 详细信息

【目的】建立从禾谷孢囊线虫及其近缘种的混合群体中检测禾谷孢囊线虫的快速分子检测方法。【方法】使用随机扩增多态性DNA(RAPD)和特征序列扩增区域(SCAR)标记的方法,运用PCR技术进行特异性检测。【结果】用本研究建立的SCAR标记快速分子检测体系对9种32个线虫种群进行检测,能够直接从混合线虫样品中检测出禾谷孢囊线虫。该检测方法对禾谷孢囊线虫的孢囊、2龄幼虫具有扩增能力,最低检出阈值为1/2000个孢囊,1/80头2龄幼虫。【结论】本研究设计的SCAR标记快速分子检测体系能够从禾谷孢囊线虫及其近缘种的混合种群中快速检测出禾谷孢囊线虫,且检测准确、灵敏度高。

关键词：禾谷孢囊线虫 SCAR标记快速分子检测

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玉米种子纯度快速分子检测技术研究

种子科技 2023年第10期41卷 31-33页

作者：胡昕山东省种子管理总站山东济南250100

种子纯度检测是产品质量检测的中心,检验种子纯度是促进农业发展和维护种业秩序的必经之路。随着信息化发展,种子纯度快速分子检测技术不断更新优化,如何使用现代化纯度快速分子检测技术验证玉米种子纯度是值得思考的问题。文章阐述了... 详细信息

种子纯度检测是产品质量检测的中心,检验种子纯度是促进农业发展和维护种业秩序的必经之路。随着信息化发展,种子纯度快速分子检测技术不断更新优化,如何使用现代化纯度快速分子检测技术验证玉米种子纯度是值得思考的问题。文章阐述了机器视觉技术、分子标记技术、DNA快速提取法,分析了玉米种子纯度快速分子检测技术应用方法,结合试验结果得出玉米种子纯度快速分子检测技术步骤以及梯度要求。

关键词：种子纯度快速分子检测检测技术

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甜菜孢囊线虫SCAR快速分子检测技术研究

甜菜孢囊线虫SCAR快速分子检测技术研究

基于SCAR标记的西班牙根结线虫快速分子检测技术的建立

中国植物保护学会2019年学术年会

作者：彭焕高海峰张瀛东李广阔吴伟王锁牢彭德良中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室新疆农业科学院植物保护研究所农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室农业部库尔勒作物有害生物科学观测实验站新疆维吾尔自治区新源县农业技术推广站

甜菜孢囊线虫（Heterodera schachtii Schmidt）是全世界重要检疫性有害生物。1850年首次在德国报道,到目前为止,已在美洲、欧洲、亚洲等50多个国家或地区有分布,包括我国在内的22个国家将其列为检疫对象。甜菜孢囊线虫是甜菜上危害最... 详细信息

甜菜孢囊线虫（Heterodera schachtii Schmidt）是全世界重要检疫性有害生物。1850年首次在德国报道,到目前为止,已在美洲、欧洲、亚洲等50多个国家或地区有分布,包括我国在内的22个国家将其列为检疫对象。甜菜孢囊线虫是甜菜上危害最严重的病原生物之一,可导致甜菜产量损失25%～50%,在欧洲每年的经济损失已经超过了9 000万欧元,严重威胁着当地甜菜生产和制糖业。本研究以甜菜孢囊线虫和近缘种孢囊线虫DNA为模板,以RAPD随机引物进行PCR扩增。结果表明,采用OPA06随机引物能够特异的从甜菜孢囊线虫中扩增出长度为1 000bp左右的条带,克隆测序后,在Genbank数据库中进行Blast比对,未发现同源的序列。在此基础上,设计出针对甜菜孢囊线虫的SCAR特异性引物（HSF1和HSR1）,能够快速的从甜菜孢囊线虫DNA中扩增出922bp的特异性条带,灵敏度检测发现,本研究设计的甜菜孢囊线虫SCAR分子标记的最低检出阈值为1/40 000个孢囊,1/320头2龄幼虫和0.001ng的甜菜孢囊线虫基因组DNA,特异性检测发现,该检测方法能够有效地将甜菜孢囊线虫和大豆孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、宽阴门孢囊线虫、旱稻孢囊线虫、玉米孢囊线虫、十字花科孢囊线虫、爱沙尼亚孢囊线虫、仙人掌皮线虫等近源种进行有效的区分,具有极高的特异性,该检测技术的开发将为甜菜孢囊线虫快速准确的诊断提供有力的技术支撑。

关键词：甜菜孢囊线虫 SCAR标记快速分子检测

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基于SCAR标记的西班牙根结线虫快速分子检测技术的建立

重组酶介导的等温扩增技术联合CRISPR-Cas13a快速检测4种腹泻病原菌

中国植物病理学会2024年学术年会

作者：王丽陈园王帅丽龙海波中国热带农业科学院环境与植物保护研究所农业农村部热带作物有害生物综合治理实验室

西班牙根结线虫(Meloidogyne hispanica Hirschmann)首次发现于塞维利亚的桃砧木(Prunus persica L.),现已证实在西班牙、巴西、法国等27个国家发生,可侵染番茄、玉米、辣椒等多种重要经济作物,造成严重的经济损失。自2017年在我国首次... 详细信息

西班牙根结线虫(Meloidogyne hispanica Hirschmann)首次发现于塞维利亚的桃砧木(Prunus persica L.),现已证实在西班牙、巴西、法国等27个国家发生,可侵染番茄、玉米、辣椒等多种重要经济作物,造成严重的经济损失。自2017年在我国首次发现其侵染危害番木瓜(Carica papayaL.)后,进一步调查表明西班牙根结线虫还对番茄、海巴戟、辣椒、苋菜、空心菜、黄瓜等造成危害。目前,国内关于西班牙根结线虫的研究相对较少,且国内外尚未开发出针对该线虫的分子快速检测技术。因此,快速准确的鉴定方法对建立有效、可持续的西班牙根结线虫管理方案至关重要。本研究通过对多条随机引物进行筛选,筛选出OPC-06随机引物能够特异、准确地从其近缘属种中检测出西班牙根结线虫,并在此基础上设计了一对SCAR引物(Mhi-F,Mhi-R)。在此SCAR标记检测体系中,检测西班牙根结线虫种群可获得约385 bp的特异性片段,对雌虫和二龄幼虫检测均可获得特异条带。同时对单个雌虫基因组DNA、单条二龄幼虫基因组DNA以及总基因组DNA进行定量检测,确定该SCAR检测体系最低检出阈值分别为1/256个单雌虫、1/64单头线虫以及65 pg/μL总基因组DNA。综上,本研究开发的基于SCAR标记的西班牙根结线虫快速鉴定技术具有特异性强、操作简单、耗时短等优点,能够满足大批量样品检测需求,可用于监测预警西班牙根结线虫的传播和扩散,对有效防控西班牙根结线虫造成的生产危害也具有重要意义。

关键词：西班牙根结线虫 SCAR标记快速分子检测

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中国食品卫生杂志 2023年第3期35卷 381-389页

作者：安柏霖苏璇郭悦王祥喜葛以跃朱凤才崔仑标南开大学药学院天津300000 江苏省疾病预防控制中心国家卫生健康委员会肠道病原微生物重点实验室江苏南京210009 天津国际生物医药联合研究院天津300000 南京医科大学江苏南京210029 中国科学院生物物理所北京100101

目的重组酶介导的等温扩增技术(RAA)联合规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a),建立对沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H74种腹泻病原菌的快速分子检测方法,即RAA-Cas13a。方法设计4种腹泻病原菌... 详细信息

目的重组酶介导的等温扩增技术(RAA)联合规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a),建立对沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H74种腹泻病原菌的快速分子检测方法,即RAA-Cas13a。方法设计4种腹泻病原菌的RAA特异性引物和CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a恒温荧光检测,以实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)为对照方法,评价RAA-Cas13a优化方法的灵敏度与特异性。结果RAA-Cas13a方法可在35 min内完成检测。检测志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7的最低检测限为10 copies/μL,沙门菌最低检测限为1 copy/μL;特异性实验表明每一种病原菌与其余10种对照细菌均无交叉反应。应用建立的方法检测200份实际样本和40份人工污染样本,结果表明同RT-qPCR检测结果一致性高(分别为Kappa=0.927和Kappa=1.000)。结论RAA-Cas13a检测方法具有灵敏度高,特异性强等优点,能用于4种腹泻病原菌的快速检测。

关键词：重组酶介导的等温扩增技术 CRISPR-Cas13a 腹泻病原菌快速分子检测

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茄匍柄霉LAMP快速检测体系的建立及应用

农业生物技术学报 2022年第10期30卷 2045-2052页

作者：谢学文刘世程石延霞张胜丰陈利达柴阿丽范腾飞李磊李宝聚中国农业科学院蔬菜花卉研究所徐州市贾汪区泰瑞农业科技有限公司

匍柄霉(Stemphylium solani)是一种重要的植物病原真菌，可侵染多种作物。环介导等温扩增(loopmediated isothermal amplification, LAMP)技术具有简便、准确、快速等突出优点，在病原菌检测领域有广泛应用。本研究以SYBR GreenⅠ为指... 详细信息

匍柄霉(Stemphylium solani)是一种重要的植物病原真菌，可侵染多种作物。环介导等温扩增(loopmediated isothermal amplification, LAMP)技术具有简便、准确、快速等突出优点，在病原菌检测领域有广泛应用。本研究以SYBR GreenⅠ为指示剂，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-2-phosphate dehydrogenase, gpd)为检测靶标基因设计6条引物(2条内引物FIP/BIP, 2条外引物F3/B3,环引物LF25/LB25)进行LAMP扩增，同时通过环引物加速反应，建立了一套茄匍柄霉LAMP快速检测体系。特异性验证结果显示，仅16株茄匍柄霉有阳性扩增，具有较高的特异性。灵敏度检测结果显示，该检测体系灵敏度达2.4 pg/μL，显著高于普通PCR检测技术。环引物加速LAMP反应结果表明，加入环引物能使反应时间缩短至27 min，可有效加速LAMP反应。通过钙黄绿素进行显色反应，在自然光下仅模板为茄匍柄霉的反应液变为绿色，其余反应液均为橙色。采用该体系检测茄匍柄霉接种后番茄(Lycopersicon esculentum)叶片病原菌含量动态变化，接种病原菌12 h时，该体系即有阳性显色反应，接种后颜色随时间推移逐渐加深，与接种病原菌后叶片发病情况的规律相同。该反应结果不借助其他仪器即可观察，环引物加速反应使检测时间进一步缩短至27 min，能够快速、准确反应病原菌含量。该体系在匍柄霉快速检测方面具有较强的优势，可用于病害潜伏、未显症期的快速检测，对及时、科学防治茄匍柄霉叶斑具有重要意义。

关键词：茄匍柄霉环介导等温扩增(LAMP) 快速分子检测

橡胶树褐根病病菌LAMP快速检测方法的建立及应用

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农业生物技术学报 2020年第6期28卷 1114-1122页

作者：董文敏贺春萍吴伟怀梁艳琼谢立李锐黄兴郑金龙习金根陆英易克贤南京农业大学植物保护学院中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室海南大学林学院

有害层孔菌(Phellinus noxius)引起的橡胶树(Hevea brasiliensis)褐根病是严重危害天然橡胶的一种根部病害。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术由于特异性强、灵敏度高、反应迅速、成本低等优势,已在... 详细信息

有害层孔菌(Phellinus noxius)引起的橡胶树(Hevea brasiliensis)褐根病是严重危害天然橡胶的一种根部病害。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术由于特异性强、灵敏度高、反应迅速、成本低等优势,已在植保等诸多领域得到广泛应用。为了建立一种能够快速、高效、准确地检测橡胶树褐根病菌的技术,本研究以SYBR GreenⅠ为指示剂,建立了橡胶树褐根病菌有害层孔菌的环介导等温扩增可视化快速检测方法。根据橡胶树褐根病菌特异的核糖体转录间隔区序列设计了4条引物(2条内引物FIP/BIP, 2条外引物F3/B3)进行LAMP扩增。对LAMP反应条件和体系进行优化,并进行特异性和灵敏度验证,最后进行田间疑似褐根病样本验证。研究确定了最佳反应体系(25μL中模板100 ng/μL,外引物F3/B3各0.2μmol/L,内引物FIP/BIP各1.2μmol/L, dNTPs 1.4 mmol/L, Mg2+6 mmol/L,甜菜碱0.8mol/L, Bst DNA polymerase 8 U/μL)和反应条件(最佳反应温度63℃,反应时间1 h)。特异性验证结果显示,橡胶树褐根病病菌LAMP产物均呈阳性(绿色),而其他病原菌组织LAMP产物均为阴性(橙色)。灵敏度检测结果显示,该体系的DNA最低检测限为1 pg/μL,比常规PCR灵敏度高1 000倍。20株田间疑似褐根样本应用LAMP体系检测,其病原检出率为85%,而常规PCR检出率为70%或75%。本研究建立的LAMP检测体系能有效用于橡胶褐根病疑似样本的快速检测,对及时科学的防控该病害具有重要意义。

关键词：橡胶树褐根病环介导等温扩增(LAMP) 有害层孔菌快速分子检测

CRISPR-Cas13a辅助RAA快速检测金黄色葡萄球菌的研究

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中国病原生物学杂志 2020年第3期15卷 253-258页

作者：苏璇葛以跃张倩朱小娟陈银吴涛乔乔赵康辰吴斌王祥喜庞正朱凤才崔仑标南开大学药学院天津300000 国家卫生健康委员会肠道病原微生物重点实验室江苏省疾病预防控制中心中国科学院生物物理研究所天津国际生物医药联合研究院

目的建立一种金黄色葡萄球菌快速分子检测技术。方法根据金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc)保守区序列设计合成特异性引物,通过对反应条件进行优化,建立金黄色葡萄球菌重组酶介导的等温扩增技术(Recombi-naseaidedamplification,RAA);... 详细信息

目的建立一种金黄色葡萄球菌快速分子检测技术。方法根据金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc)保守区序列设计合成特异性引物,通过对反应条件进行优化,建立金黄色葡萄球菌重组酶介导的等温扩增技术(Recombi-naseaidedamplification,RAA);表达纯化CRISPR-Cas13a蛋白,设计特异的crRNA(CRISPR RNA),以crRNA引导CRISPR-Cas13a蛋白对RAA产物进行检测;对优化的方法进行灵敏性和特异性评价,同时采用该方法与real-timePCR法对食品标本中的金黄色葡萄球菌进行检测,评价方法的一致性。结果CRISPR-Cas13a辅助RAA检测金黄色葡萄球菌的灵敏度为101 CFU/ml,高于real-timePCR,约102 CFU/ml,检测时间仅需30min,与其他食源性致病菌无交叉反应;该方法和real-timePCR检测80份食品样品的阳性率均为8.75%,具有高度一致性(Kappa=1,P>0.05)。结论建立的CRISPR-Cas13a辅助RAA方法具有简便、快速、灵敏、特异等优点,为金黄色葡萄球菌的检测提供了新的技术手段。

关键词： RAA CRISPR-Cas13a 金黄色葡萄球菌快速分子检测

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三七根腐病菌茄腐镰刀菌的实时荧光LAMP快速检测方法的建立与应用

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农业生物技术学报 2024年第4期32卷 939-948页

作者：车晓莉梁婷婷曲媛刘迪秋昆明理工大学生命科学与技术学院云南省三七资源可持续利用重点实验室

根腐病是我国三七（Panax notoginseng）种植区高发的一种严重病害，茄腐镰刀菌（Fusarium solani）是引起三七根腐病的重要病原菌。本研究建立了一套对三七根腐病菌茄腐镰刀菌进行现场快速检测的实时荧光环介导等温扩增（loop-mediated... 详细信息

根腐病是我国三七（Panax notoginseng）种植区高发的一种严重病害，茄腐镰刀菌（Fusarium solani）是引起三七根腐病的重要病原菌。本研究建立了一套对三七根腐病菌茄腐镰刀菌进行现场快速检测的实时荧光环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）体系。首先通过PCR反应筛选D-氨基酸氧化酶基因（D-amino acid oxidase gene, DAO）为特异性检测茄腐镰刀菌的基因位点，并对该基因设计LAMP反应的特异性引物组并优化其反应条件，其中65℃为最佳反应温度，MgSO4的最佳浓度为6 mmol/L;dNTPs的最佳浓度为0.6 mmol/L；有环引物存在的情况下，扩增效率更高。分析了LAMP法检测茄腐镰刀菌的灵敏度，模板浓度可低至0.009 pg/μL。最后结合DNA免提法以及钙黄绿素显色法建立了三七根腐病菌茄腐镰刀菌的LAMP现场快速检测技术。本研究为三七种植以及种子种苗交易过程中的根腐致病菌茄腐镰刀菌的快速检测提供技术支撑。

关键词：三七茄腐镰刀菌实时荧光LAMP 快速分子检测