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大熊猫轮状病毒PCR检测方法的建立及应用

兽类学报 2021年第3期41卷 254-260页

作者：苏小艳李林燕霞张东升侯蓉刘颂蕊成都大熊猫繁育研究基地成都610081 四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室成都610081 四川省大熊猫科学研究院成都610081

轮状病毒是威胁大熊猫健康的主要病原微生物之一。为了对大熊猫轮状病毒进行快速、方便且准确地检测,研发适合于基层饲养单位和保护区的检测方法是非常有必要的。本研究通过合成大熊猫轮状病毒Vp7基因序列,构建了PUC-VP7的重组质粒,并... 详细信息

轮状病毒是威胁大熊猫健康的主要病原微生物之一。为了对大熊猫轮状病毒进行快速、方便且准确地检测,研发适合于基层饲养单位和保护区的检测方法是非常有必要的。本研究通过合成大熊猫轮状病毒Vp7基因序列,构建了PUC-VP7的重组质粒,并将其作为阳性对照对大熊猫轮状病毒样本进行PCR检测和分析。结果表明,在进行PCR扩增分析时,该质粒和病毒cDNA二者均在340 bp处出现了特异性条带。此外,对收集到的45份大熊猫粪便样本进行轮状病毒抗原检测时,其中2份样品在340 bp处出现条带,该基因片段与大熊猫轮状病毒CH-1株的相似性为99.89%。本研究构建的PUC-VP7质粒不但可以作为大熊猫轮状病毒PCR检测中的阳性质控品,而且还能有效地促进该PCR病毒检测技术在基层饲养单位和保护区的推广和应用。

关键词：大熊猫轮状病毒 PCR检测 Vp7基因质粒构建

大熊猫轮状病毒CH-1株VP1基因的克隆和生物信息学分析

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中国兽医科学 2014年第1期44卷 27-32页

作者：郭玲杨绍林张和民李德生王承东曹三杰黄晓波文心田陈世界颜其贵四川农业大学动物医学院四川雅安625014 四川省出入境检疫检验局四川成都610041 中国保护大熊猫研究中心四川雅安625000 四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川雅安625014

为研究大熊猫源轮状病毒(RV)CH-1株外衣壳蛋白VP1基因的结构及功能,采用MA-104细胞增殖大熊猫源RV,提取总RNA,运用RT-PCR扩增VP1基因,将阳性克隆进行测序,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示,成功获得了长3 287bp的... 详细信息

为研究大熊猫源轮状病毒(RV)CH-1株外衣壳蛋白VP1基因的结构及功能,采用MA-104细胞增殖大熊猫源RV,提取总RNA,运用RT-PCR扩增VP1基因,将阳性克隆进行测序,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示,成功获得了长3 287bp的GPRV VP1蛋白基因(GenBank登录号:HQ641297);经生物信息学分析,此序列包含有一个3 267bp的完整开放阅读框,编码1 089个氨基酸;无信号肽;无跨膜区,其整个蛋白都位于病毒膜外区;抗原表位预测显示VP1蛋白有41个抗原表位;系统进化树分析显示大熊猫轮状病毒CH-1株VP1基因与猪A组轮状病毒VP1基因的进化距离最近。本研究成功获得了大熊猫源RV VP1基因,为今后研究此基因的生物学功能奠定了基础。

关键词：大熊猫轮状病毒 VP1基因克隆生物信息学分析

壳寡糖对大熊猫轮状病毒VP6-VP7亚单位疫苗免疫作用的研究

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浙江农业学报 2019年第12期31卷 2005-2010页

作者：文继锋申欢欢阴文奇龚永平易可可邓英颜其贵四川农业大学动物医学院

为研究壳寡糖(COS)对大熊猫轮状病毒(GPRV)重组蛋白VP6-VP7的免疫增强作用,以原核表达的重组VP6-VP7蛋白为抗原,添加浓度为2.0 mg·mL-1 COS作为免疫佐剂制成GPRV VP6-VP7-COS亚单位疫苗。选取SPF级昆明小鼠78只随机分为4组。PC组免疫... 详细信息

为研究壳寡糖(COS)对大熊猫轮状病毒(GPRV)重组蛋白VP6-VP7的免疫增强作用,以原核表达的重组VP6-VP7蛋白为抗原,添加浓度为2.0 mg·mL-1 COS作为免疫佐剂制成GPRV VP6-VP7-COS亚单位疫苗。选取SPF级昆明小鼠78只随机分为4组。PC组免疫纯化的重组VP6-VP7蛋白,A组免疫VP6-VP7-COS疫苗,B组免疫VP6-VP7氢氧化铝胶佐剂疫苗,NC组注射PBS(对照组)。在0、15、30 d进行免疫接种,每次接种完成后于每周每组随机挑选6只小鼠采血分离血清,分别检测小鼠血清IgG、IgA抗体效价、T淋巴细胞转化率、细胞因子的含量,评估COS对GPRV重组VP6-VP7蛋白诱导的免疫应答反应的调节作用。试验结束后,取各组小鼠注射部位的肌肉组织进行病理组织学分析,以评价COS作为免疫佐剂的安全性。结果表明,VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组、VP6-VP7-COS组免疫小鼠血清中所产生的IgG均显著(P<0.05)高于其他各组。VP6-VP7-COS组小鼠产生的IgA抗体含量显著(P<0.05)高于其他各组,VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组和VP6-VP7-COS物理混合组诱导T淋巴细胞增殖的能力显著(P<0.05)高于VP6-VP7蛋白组。VP6-VP7-COS组、VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组中IL-2、IL-4、IL-5及IFN-γ的含量均显著(P<0.05)高于其他组,组织病理学分析结果表明,以COS作为佐剂的VP6-VP7亚单位疫苗免疫小鼠后注射部位的肌肉组织未出现病理变化。本研究表明,GPRV重组蛋白VP6-VP7能够显著诱导动物机体的免疫应答,壳寡糖对GPRV VP6-VP7蛋白呈现较好的免疫增强效果。本研究为研制安全、无副作用和高免疫保护力的GPRV亚单位疫苗提供了参考。

关键词：大熊猫轮状病毒 VP6-VP7蛋白壳寡糖免疫增强作用亚单位疫苗

携大熊猫轮状病毒CH-1株VP4-VP7双基因的减毒沙门氏菌的构建与免疫原性研究

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携大熊猫轮状病毒CH-1株VP4-VP7双基因的减毒沙门氏菌的构建与免...

作者：马磊四川农业大学

学位级别：硕士

大熊猫轮状病毒(Giant Panda Rotavirus, GPRV)因引起幼龄大熊猫(5-11月龄)传染性和顽固性腹泻,导致多器官衰竭而死亡,其发病率可达100%,对大熊猫的种群扩大造成巨大威胁。目前主要是依靠加强饲养管理预防轮状病毒感染,但由于环境等因... 详细信息

大熊猫轮状病毒(Giant Panda Rotavirus, GPRV)因引起幼龄大熊猫(5-11月龄)传染性和顽固性腹泻,导致多器官衰竭而死亡,其发病率可达100%,对大熊猫的种群扩大造成巨大威胁。目前主要是依靠加强饲养管理预防轮状病毒感染,但由于环境等因素的影响效果不是很理想,为此免疫预防成了防制该病的主要措施和研究热点。本试验对以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的大熊猫轮状病毒VP4和VP7双基因疫苗的构建及对小鼠免疫试验进行研究。1.大熊猫轮状病毒VP4和VP7基因的克隆及鉴定根据GenBank中大熊猫轮状病毒CH-1株VP4和VP7基因序列,分别设计引物,经RT-PCR成功得到GPRV-VP4(2331bp)和GPRV-VP7(981bp)基因的核苷酸序列,分别进行克隆后,测序鉴定得到正确的GPRV-VP4和GPRV-VP7基因核苷酸序列。2.大熊猫轮状病毒VP4和VP7双基因的减毒沙门氏菌的构建选择真核表达质粒pVAX1,将正确的GPRV-VP4和GPRV-VP7基因分别插入表达载体pVAX1中构建含有VP4和VP7基因的单基因表达载体pVAX1-GPR V-VP4、pVAX1-GPRV-VP7和双基因表达载体pVAX1-GPRV-VP4-VP7,并将重组质粒转化减毒沙门氏菌S.L7207得到重组菌株S.L7207/pVAX1-GPRV-VP4、S. L7207/pVAX1-GPRV-VP7和S.L7207/pVAX1-GPRV-VP4-VP7。经PCR、酶切和测序鉴定,表明重组菌构建成功;分别提取重组菌质粒转染IPEC-J2细胞,经间接免疫荧光试验和RT-PCR检测并测序鉴定后,表明重组质粒均能在IPEC-J2细胞中表达。3.携带GPRV-VP4-VP7基因的DNA疫苗的免疫学性质对重组菌株S.L7207/pVAX1-VP4-VP7进行体外稳定性检测,并以不同剂量口服接种BALB/c小鼠,分析其安全性、目的基因在体内的转录和体内稳定性,进行小鼠血清抗体检测和细胞因子检测,并用MTT法检测脾淋巴细胞的增殖等特性鉴定。结果表明,重组菌在Kan抗性下稳定性好,以安全剂量1×108CFU口服接种小鼠后,重组菌携带的S.L7207/pVAX1-VP4-VP7接种小鼠后3d在肠道部位有VP4和VP7基因的转录,并且重组菌在小鼠体内15d内比较稳定;重组菌S.L7207/pVAX1-VP4-VP7免疫组产生抗体与对照组相比差异显著(P大熊猫轮状病毒疫苗研究奠定基础。

关键词：大熊猫轮状病毒 VP4 VP7 减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫原性

大熊猫源轮状病毒环介导等温扩增检测方法的建立及病毒的G/P血清分型

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大熊猫源轮状病毒环介导等温扩增检测方法的建立及病毒的G/P血清...

作者：蒋金蓁四川农业大学

学位级别：硕士

大熊猫轮状病毒(Giant Panda Rotavirus,GPRV)主要感染幼龄大熊猫,对大熊猫的繁育、健康及野化放归带来重大威胁。因此,加强GPRV感染的监测和开发简单、快速、高灵敏度的实验室诊断方法成为防控重点。通过对GPRV血清分型的鉴定,分析其... 详细信息

大熊猫轮状病毒(Giant Panda Rotavirus,GPRV)主要感染幼龄大熊猫,对大熊猫的繁育、健康及野化放归带来重大威胁。因此,加强GPRV感染的监测和开发简单、快速、高灵敏度的实验室诊断方法成为防控重点。通过对GPRV血清分型的鉴定,分析其流行趋势和遗传进化规律,为疫苗的选择和研发提供基础数据。1.大熊猫轮状病毒环介导等温扩增方法的建立对于病毒检测而言,环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)是快速且灵敏的分子生物学诊断方法,该方法成本低廉、操作简单、不需要高端仪器,还可通过肉眼直接观察结果,但目前还未用于检测GPRV。故本研究根据大熊猫轮状病毒CH-1株VP4基因设计3对引物,建立大熊猫轮状病毒可视化LAMP检测技术,对其进行条件优化,检测其特异度、灵敏度,并用所建立LAMP检测方法对2017年至2019年共91份大熊猫粪便样本进行GPRV检测,用荧光定量PCR验证吻合度。结果表明,在扩增体系中加入终浓度为1×可见光染料可实现LAMP检测结果的可视化观察,阳性扩增样品的颜色从紫色变为蓝色,而阴性扩增样品未见颜色变化。当Mg浓度为8.0 m M、甜菜碱浓度为0.6 M、Bst DNA聚合酶浓度为12 U时,在62℃反应40分钟后可得到最佳扩增效果。该方法特异性强,对一些常见的大熊猫感染病毒如犬瘟热病毒、细小病毒等无交叉反应;其灵敏度比常规PCR高100倍,最低检测限为50 fg RNA。对2017年至2019年共91份大熊猫粪便样本进行检测,其中39份为GPRV阳性,总阳性率为42.86%,荧光定量PCR验证其阳性符合率为97.50%,阴性符合率为98.08%。2.G/P血清型鉴定及其遗传进化分析本研究通过建立的LAMP检测方法筛选出GPRV阳性的大熊猫粪便样本,采用巢氏PCR方法对阳性样本进行G/P血清型鉴定,分别构建p MD19T-VP7、p MD19T-VP4重组质粒并测序。将测序结果通过BLAST与Gen Bank中已报道的轮状病毒VP4、VP7基因序列进行同源性比对,采用最大似然法(Maximum Likelihood,ML)构建进化树,通过软件分析其平均进化速率和选择压力。结果表明2017年至2019年大熊猫轮状病毒的主要流行血清型为G2P[8],偶有检出G1、G4和P[11]血清型。新的G/P血清型均与GPRV CH-1株VP7、VP4基因同源性均在98%以上,猜测所检出的新血清型为CH-1株进化导致的血清型改变。VP7和VP4基因的平均进化速率分别为1.93×10和1.81×10替换·位点·年。分析其选择压力发现,VP7基因筛选出正向选择位点1个,VP4基因筛选出正向选择位点和负向选择位点各6个,以上正向选择位点的分析对识别免疫逃避、抗药性突变、疾病防治有积极作用,同时VP4基因在适应性进化过程中还承受一定程度的负向选择压力,这种压力能够保证RNA病毒的稳定性。本研究建立了GPRV可视化LAMP检测方法,相较常规PCR,该方法成本低廉、反应快速、特异性强、灵敏度高,荧光定量PCR验证其吻合度可靠,可以作为临床早期快速检测GPRV的有效工具,实现对该病的高效监测。对大熊猫粪便样品进行血清分型鉴定发现,目前的主要流行血清型为G2P[8],通过遗传分析猜测该流行血清型主要由GPRV CH-1株进化导致其血清型改变。掌握GPRV的分子流行趋势,对其进行遗传进化分析,这对疫苗的开发和评估疫苗的应用效果的影响具有重要价值。

关键词：大熊猫轮状病毒 LAMP G/P血清型鉴定遗传进化