携大熊猫轮状病毒CH-1株VP4-VP7双基因的减毒沙门氏菌的构建与免疫原性研究

作     者：马磊 

作者单位：四川农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：颜其贵

授予年度：2013年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：大熊猫轮状病毒 VP4 VP7 减毒鼠伤寒沙门氏菌 免疫原性 

摘      要：大熊猫轮状病毒(Giant Panda Rotavirus, GPRV)因引起幼龄大熊猫(5-11月龄)传染性和顽固性腹泻,导致多器官衰竭而死亡,其发病率可达100%,对大熊猫的种群扩大造成巨大威胁。目前主要是依靠加强饲养管理预防轮状病毒感染,但由于环境等因素的影响效果不是很理想,为此免疫预防成了防制该病的主要措施和研究热点。本试验对以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的大熊猫轮状病毒VP4和VP7双基因疫苗的构建及对小鼠免疫试验进行研究。1.大熊猫轮状病毒VP4和VP7基因的克隆及鉴定根据GenBank中大熊猫轮状病毒CH-1株VP4和VP7基因序列,分别设计引物,经RT-PCR成功得到GPRV-VP4(2331bp)和GPRV-VP7(981bp)基因的核苷酸序列,分别进行克隆后,测序鉴定得到正确的GPRV-VP4和GPRV-VP7基因核苷酸序列。2.大熊猫轮状病毒VP4和VP7双基因的减毒沙门氏菌的构建选择真核表达质粒pVAX1,将正确的GPRV-VP4和GPRV-VP7基因分别插入表达载体pVAX1中构建含有VP4和VP7基因的单基因表达载体pVAX1-GPR V-VP4、pVAX1-GPRV-VP7和双基因表达载体pVAX1-GPRV-VP4-VP7,并将重组质粒转化减毒沙门氏菌S.L7207得到重组菌株S.L7207/pVAX1-GPRV-VP4、S. L7207/pVAX1-GPRV-VP7和S.L7207/pVAX1-GPRV-VP4-VP7。经PCR、酶切和测序鉴定,表明重组菌构建成功;分别提取重组菌质粒转染IPEC-J2细胞,经间接免疫荧光试验和RT-PCR检测并测序鉴定后,表明重组质粒均能在IPEC-J2细胞中表达。3.携带GPRV-VP4-VP7基因的DNA疫苗的免疫学性质对重组菌株S.L7207/pVAX1-VP4-VP7进行体外稳定性检测,并以不同剂量口服接种BALB/c小鼠,分析其安全性、目的基因在体内的转录和体内稳定性,进行小鼠血清抗体检测和细胞因子检测,并用MTT法检测脾淋巴细胞的增殖等特性鉴定。结果表明,重组菌在Kan抗性下稳定性好,以安全剂量1×108CFU口服接种小鼠后,重组菌携带的S.L7207/pVAX1-VP4-VP7接种小鼠后3d在肠道部位有VP4和VP7基因的转录,并且重组菌在小鼠体内15d内比较稳定;重组菌S.L7207/pVAX1-VP4-VP7免疫组产生抗体与对照组相比差异显著(P0.05),重组菌刺激脾淋巴细胞增殖与对照组差异显著(P0.05),结合血清细胞因子检测结果说明重组菌株具有良好的免疫原性。综合试验结果表明,本试验构建的以减毒沙门氏菌为载体的疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性,可为大熊猫轮状病毒疫苗研究奠定基础。