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PCV-3/CN/Guizhou/ASXX/2017321株全基因组克隆与序列分析

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黑龙江畜牧兽医 2019年第12期 60-63,66页

作者：曾智勇张爱琼梁海英何小莉咸文陈娟吴好叶黄二素贵州大学动物科学学院

为了获得猪圆环病毒3型(PCV-3)全基因组克隆及序列,试验采用PCR技术,应用PCV-3全基因组特异性引物,对PCV-3阳性的腹泻仔猪肠内容物进行了PCV-3基因组的扩增和克隆测序,并运用DNAStar、MEGA5等软件对该PCV-3基因组序列进行了比对分析。... 详细信息

为了获得猪圆环病毒3型(PCV-3)全基因组克隆及序列,试验采用PCR技术,应用PCV-3全基因组特异性引物,对PCV-3阳性的腹泻仔猪肠内容物进行了PCV-3基因组的扩增和克隆测序,并运用DNAStar、MEGA5等软件对该PCV-3基因组序列进行了比对分析。结果表明:扩增克隆得到1株PCV-3分离株,命名为PCV-3/CN/Guizhou/ASXX/2017321株,全基因组大小为2 000 bp,其ORF2大小为645 bp,且存在多处碱基突变。与国外PCV-3毒株相比,全基因组核苷酸序列相似性为98. 7%~99. 0%;与国内毒株相比,全基因组核苷酸序列相似性为97. 3%~99. 7%;与PCV-2毒株相比,全基因组核苷酸序列相似性仅为47. 3%~48. 3%,差异性较大。基于PCV-3基因组核苷酸序列的遗传进化分析结果表明,PCV-3/CN/Guizhou/ASXX/2017321株与国内PCV-3 Chongqing-147/2016株(KY075990)、Jiangxi-62/2016 (KY075989)株、Jiangxi-3/2016 (MF589106)株,与国外US/SD/2016(KX966193)株处于同一独立的进化分支,亲缘关系较近;与其他国内外PCV-3毒株则处于不同的进化分支,亲缘关系较远。根据PCV-3 Cap蛋白第24位和第27位氨基酸序列特征可知,PCV-3/CN/Guizhou/ASXX/2017321株属于PCV-3c基因型。说明贵州省猪群中存在PCV-3,且分离得到的PCV-3/CN/Guizhou/ASXX/2017321株属于PCV-3c基因型。

关键词： PCV-3 基因组克隆序列分析 Cap蛋白 PCR技术

猪圆环病毒2型HBZX株的全基因组克隆及序列分析

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湖北农业科学 2008年第10期47卷 1117-1121页

作者：温国元罗青平杨峻李坤商雨张蓉蓉罗玲王红琳艾地云邵华斌湖北省农业科学院畜牧兽医研究所武汉430209

参照GenBank发表的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2,PCV2)序列,设计合成了1对用于扩增PCV2全长基因组的特异性引物,从患断奶后仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)的病料中,采用PCR方法克隆了PCV2 HBZX株的全长基因组序列,并进行了序... 详细信息

参照GenBank发表的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2,PCV2)序列,设计合成了1对用于扩增PCV2全长基因组的特异性引物,从患断奶后仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)的病料中,采用PCR方法克隆了PCV2 HBZX株的全长基因组序列,并进行了序列测定与分析。结果显示,PCV2 HBZX株的基因组全长为1 767nt;同源性比较发现,HBZX株与其他PCV2株的核苷酸同源性为95.0%～98.9%;遗传进化树分析表明,根据PCV2全基因组序列和ORF2编码蛋白的氨基酸序列所绘制的遗传进化树相似度较高;PCV2可分为两个亚型,以中国株为代表的亚洲株和以加拿大株为代表的美洲株分布在亚型1中,以法国株为代表的欧洲株分布在亚型2中。说明PCV2各分离株之间存在较为明显的地理位置上的相关性。

关键词：猪圆环病毒2型基因组克隆同源性进化树

香蕉束顶病毒基因组克隆及DNA2 ORF分析与酵母双杂交自激活验证

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香蕉束顶病毒基因组克隆及DNA2 ORF分析与酵母双杂交自激活验证

作者：余乃通海南大学

学位级别：硕士

香蕉是一种重要的热带、亚热带水果,已成为该区域120多个国家和地区4亿人的重要食物和经济来源。香蕉束顶病（Banana bunchy top disease,BBTD）是香蕉重要的毁灭性病害之一,特别在20世纪,它威胁着包括亚洲、非洲和南太平洋地区约世界... 详细信息

香蕉是一种重要的热带、亚热带水果,已成为该区域120多个国家和地区4亿人的重要食物和经济来源。香蕉束顶病（Banana bunchy top disease,BBTD）是香蕉重要的毁灭性病害之一,特别在20世纪,它威胁着包括亚洲、非洲和南太平洋地区约世界四分之一香蕉产区的生产。香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus, BBTV）作为香蕉束顶病的病原物,2005年国际病毒分类委员会把它归属到矮缩病毒科（Nanaviridae）香蕉束顶病毒属（.Babuvirus）,成为该属的唯一成员。现在一致认为BBTV病毒颗粒为18～20nm的等径粒体,基因组至少由6个大小在1.0-1.1kb之间的环状ssDNA组分组成。目前,NCBI中的GenBank收录完整的BBTV基因组序列数量有限,且相关蛋白功能研究少有报道。本文以中国海南省海口市地区染病香蕉幼嫩假茎和叶片（BBTV HaiKou2和BBTV HaiKou4）为材料,提取总DNA为模板,扩增两个分离物的satelliteDNA组份,并分析其特点及编码蛋白的理化性质。通过PCR技术进一步克隆了两分离物的全基因序列,利用各种生物学软件对该病毒的序列结构特征、编码蛋白的功能及基因分子进化等进行了分析和预测。并对Haikou4BBTV DNA2ORF进行验证：通过RACE手段明确其编码区、非编码区及其蛋白大小等特征,首次对Southeast Asian group Haikou4BBTV DNA2ORF进行详细的研究和分析。最后,把DNA2ORF构建到酵母双杂交（ProQuestTM Two-Hybrid System, Invitrogen）的诱饵质粒中,自激活验证,结果表明在3-AT浓度为25mM的Sc-Leu-Trp-His平板上生长较弱,pDESTTM32-DNA2ORF/MaV203在3-AT浓度为50mM的Sc-Leu-Trp-His平板上基本已不生长,诱饵质粒自激活可被浓度为50mM的3-AT所抑制,因此,3-AT浓度为50mM的Sc-Leu-Trp-His平板可以用于后续酵母双杂交与香蕉总cDNA文库进行筛选。该研究对于世界热带、亚热带地区各种BBTV分离物的系统进化关系提供一定的研究依据,也对BBTV DNA2编码蛋白的功能研究奠定一定的前期工作。本文获得的主要结论如下： 1.通过PCR和反向PCR法克隆了香蕉束顶病毒海口分离物2（命名为BBTV Haikou2）和海口分离物4（命名为BBTV Haikou4）的全基因组序列。结果表明,Haikou2DNA1～6, Satellite DNA序列全长分别为1103、1067、1058、1041、1013、1082nt和1093nt。Haikou4DNA1～6序列全长分别为1103、1055、1059、1041、1013和1081nt。两分离物各组分非编码区各包含一个茎环共同区和一个主要共同区,同源性较高;编码区均编码一个开放阅读框（ORF）,其中DNA1ORF内部还有一个小的ORF。序列分析表明,两分离物与其它分离物间的DNA1最为保守,DNA2变异最大。Karan的分类方法,把BBTV分为亚洲组和南太平洋组,但是近年来由于BBTV在非洲等其他国家陆续的发现,以及局限于亚洲东南部,我们把BBTV的组分进行再次划分,命名其为South-east Asian group和Pacific-Indian ocean group。本文的Haikou2和Haikou4分离物均属于South-east Asian group。 2. BBTV Haikou2分离物扩增获得Satellite DNA组份,编码一个33.1kDa的复制起始蛋白,而Haikou4无该组分。Satellite DNA UTR,总长度为238bp,12个motif,其中不乏有TATA box、archA、archB等调控位点。但是与DNA1～DAN6上的非常保守的CR-SL,CR-M序列相比差异甚大。Satellite DNA复制所需的复制酶来自自身的编码蛋白（Rep）。而DNA1-DAN6组份的复制来自DNA1编码的复制蛋白（mRep）。应用生物信息学的方法对BBTV Haikou2satellite DNA编码蛋白的理化性质、结构组成、信号肽、磷酸化、二级结构、三级结构与功能结构域等作了较为详细的分析与预测,并与DNA1mRep进行比较,为海南BBTV Satellite DNA的深入研究奠定了重要基础。 3.以海南染病香蕉BBTV Haikou2和Haikou4样品为材料,提取总RNA,反转录成双链cDNA,利用3’和5’Race技术确定海南BBTV Haikou2和4DNA2的ORF。并与澳大利亚分离物的ORF

关键词：香蕉束顶病毒基因组克隆 DNA2 开放阅读框酵母双杂交自激活

轮状病毒的LLR疫苗株全基因组克隆及结构蛋白VP6基因遗传特征

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微生物学免疫学进展 2015年第1期43卷 1-7页

作者：赵雅静魏然冯德杰刘晨鸣魏至栋高雪军朱莉萍兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心甘肃兰州730046

目的了解轮状病毒（RV）的LLR疫苗株全基因组基因和蛋白特征、完善关键基因遗传稳定性研究,为疫苗的质量控制和研发提供依据.方法将LLR株毒种第38代在原代牛肾细胞上连续传至49代,提取第38、43、44、49代病毒RNA.通过RT-PCR方法扩增LL... 详细信息

目的了解轮状病毒（RV）的LLR疫苗株全基因组基因和蛋白特征、完善关键基因遗传稳定性研究,为疫苗的质量控制和研发提供依据.方法将LLR株毒种第38代在原代牛肾细胞上连续传至49代,提取第38、43、44、49代病毒RNA.通过RT-PCR方法扩增LLR株（38代）全基因组11个dsRNA片段和传代病毒VP6基因,分别将其克隆到pGEM-T载体中,进行序列测定与分析.结果 LLR株全基因组11条RNA,由18 498个核苷酸组成,共编码5 796个氨基酸;全基因组研究表明,所克隆的LLR株属于G10P[15]/NSP4[A]/SG Ⅰ基因型.LLR株VP6基因全长1 356 bp,含编码397个氨基酸的单一的开放读码框架（ORF）.各代次病毒的VP6基因核苷酸与推导的氨基酸变化完全一致,与GenBank中LLR参考株（L11595）同源性分别为99.9％和99.7％.与16株SG Ⅰ亚群RV代表株之间,核苷酸与推导的氨基酸序列同源性分别为84.0％～ 99.7％和97.0％～ 99.2％;与不同亚群RV代表株之间,VP6基因核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为77.7％～ 82.2％和92.2％～93.5％;LLR株各代病毒VP6基因核苷酸、氨基酸序列高度保守,各关键功能区未发生变异.结论 LLR疫苗株关键基因遗传特性稳定,为在分子水平保证LLR株毒种及其生产疫苗的安全性提供了依据;其全基因组克隆,为进一步研究RV生物学、免疫学和确定该病毒的分类学地位提供了科学依据.

关键词：轮状病毒兰州羔羊轮状病毒(LLR)株基因组克隆 VP6基因遗传稳定性

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一种实用的双链RNA病毒基因组克隆方法

长江大学学报(自科版)医学卷 2005年第2期 71-73+108页

作者：章松柏吴祖建段永平谢联辉林奇英福建农林大学植物病毒所福建农林大学植物病毒所福建福州350002

以克隆水稻矮缩病毒(Ricedwarfvirus,RDV)基因组片段S11、S12为例,报道一种克隆植物dsRNA病毒基因组的方法。具体过程为:利用T4RNA连接酶将5′磷酸、3′氨基修饰的引物Primer1连接到RDV病毒基因组第11、12片段dsRNA的3′OH端,经逆转录... 详细信息

以克隆水稻矮缩病毒(Ricedwarfvirus,RDV)基因组片段S11、S12为例,报道一种克隆植物dsRNA病毒基因组的方法。具体过程为:利用T4RNA连接酶将5′磷酸、3′氨基修饰的引物Primer1连接到RDV病毒基因组第11、12片段dsRNA的3′OH端,经逆转录、退火、补齐形成全长双链cDNA,使用单一的互补引物Primer2进行PCR扩增,扩增产物克隆在pMD18T载体上,对重组子进行两次限制性内切酶分析,结合序列测定分离鉴定S11、S12。结果表明,这种方法能同时克隆RDV基因片段S11、S12,是一种有效实用的dsRNA病毒基因组克隆方法。

关键词： dsRNA病毒基因组克隆单引物扩增

兔出血症病毒基因组的克隆及克隆基因的酶切图谱

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病毒学报 1992年第3期8卷 245-251页

作者：袁世山徐为燕杜念兴高谦陈章良南京农业大学兽医微生物教研室北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室

本试验用甘油-酒石酸钾密度梯度离心纯化了兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV),所得病毒制剂实心颗粒占90％,没有宿主核酸污染。在常规SDS-蛋白酶K法的基础上,建立了一种耗时短、重复性高的RHDV核酸抽提程序。按照细... 详细信息

本试验用甘油-酒石酸钾密度梯度离心纯化了兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV),所得病毒制剂实心颗粒占90％,没有宿主核酸污染。在常规SDS-蛋白酶K法的基础上,建立了一种耗时短、重复性高的RHDV核酸抽提程序。按照细小病毒基因组的特性,在体外合成了RHDV dsDNA,证明兔出血症病毒基因组是具有3′端发夹结构的ssDNA。以核酸酶S1修饰RHDV dsDNA,将其克隆入BS质粒载体,转化大肠杆菌DH5株。经筛选鉴定,共得RHDV DNA克隆23个,其中最大者(pYC-2)为4.6kb。选用18种限制性内切酶作酶谱分析,结果表明,12种酶在pYC-2克隆基因上不存在切点;以双酶法,用Cla Ⅰ、HincⅡ,Pvu Ⅰ、Bgl Ⅱ和Hpa Ⅰ绘制出pYC-2DNA的酶切图谱。

关键词：兔出血症病毒基因组克隆酶切图谱

禽腺联病毒全基因组的克隆及感染性病毒的拯救

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中国预防兽医学报 2007年第11期29卷 825-829页

作者：王建业孙怀昌朱国强扬州大学兽医学院江苏扬州225009

为了克隆禽腺联病毒(Avian adeno-associated virus,AAAV)全基因组用于构建基因转移载体研究,以鸡胚致死孤儿病毒(CELO)作为辅助病毒与AAAV共接种SPF鸡胚进行AAAV的增殖,将AAAV约4.7kb双链基因组DNA与pCR2.1载体连接,构建了含AAAV全基... 详细信息

为了克隆禽腺联病毒(Avian adeno-associated virus,AAAV)全基因组用于构建基因转移载体研究,以鸡胚致死孤儿病毒(CELO)作为辅助病毒与AAAV共接种SPF鸡胚进行AAAV的增殖,将AAAV约4.7kb双链基因组DNA与pCR2.1载体连接,构建了含AAAV全基因组的重组质粒pAAAV并进行了测序。序列分析表明,AAAV YZ-1株的基因组为4684bp,两端具有141bp的末端倒置重复序列和Rep蛋白结合位点特征序列,与GenBank中收录的AAAV DA-1株和VR-865株的核苷酸序列同源性分别为95.0%和92.2%。将pAAAV质粒转染CELO病毒感染的鸡胚肝细胞系,获得了感染性AAAV病毒粒子,结果证明克隆的AAAV基因组中存在与病毒复制和包装相关的正确关键序列,可用于重组AAAV载体的构建。

关键词：禽腺联病毒基因组克隆序列分析病毒拯救

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广西猪瘟流行毒株全基因组的克隆与序列分析

中国兽医学报 2005年第2期25卷 125-128页

作者：吴显实罗廷荣廖素环刘芳陆芹章黄伟坚温荣辉秦爱珍余克伦广西大学动物科学技术学院广西南宁530005

参考已发表的猪瘟病毒 (CSFV) Shimen株、HCL V株、Paderborn株的核苷酸序列 ,设计并合成 1 1对引物 ,应用RT- PCR技术 ,成功地分 1 1个片段扩增了 CSFV广西流行毒株 GXWZ0 2的全基因组。将这 1 1个基因片段克隆 ,并测定了其核苷酸序列... 详细信息

参考已发表的猪瘟病毒 (CSFV) Shimen株、HCL V株、Paderborn株的核苷酸序列 ,设计并合成 1 1对引物 ,应用RT- PCR技术 ,成功地分 1 1个片段扩增了 CSFV广西流行毒株 GXWZ0 2的全基因组。将这 1 1个基因片段克隆 ,并测定了其核苷酸序列。应用计算机生物软件 Vector NTI将 1 1个基因片段进行拼接 ,确认 CSFV GXWZ0 2株全基因组序列的长度为 1 2 2 96个核苷酸 (Gen Bank收录号 AY3 6 776 7)。将 GXWZ0 2株与国内外已发表的 Shimen、HCL V、3 9、Brescia、Eystrup、Glentorf、Alfort1 87、Paderborn、CS、AL D、GPE- 、P97、L PC毒株进行全基因组核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较 ,核苷酸同源性分别为 85 .4 %、 84 .6 %、88.7%、85 .7%、 85 .7%、 85 .3 %、85 .6 %、 95 .3 %、 85 .7%、85 .7%85 .4 %、83 .4 %、84 .3 % ,推定的氨基酸同源性分别为 92 .6 %、91 .7%、94 .2 %、 93 .1 %、92 .9%、92 .3 %、 93 .0 %、97.7%、92 .6 %、93 .0 %、92 .6 %、90 .5 %、90 .6 %。 GXWZ0 2与 Shimen、HCL V的全基因组序列及推定的氨基酸序列有明显差异 ,表明 GXWZ0 2株在遗传性和抗原性上发生了较明显的变化。系统发育树分析 ,所比较的 1 4株 CSFV被分为2个群 :GXWZ0 2、Paderborn和 3 9这 3个毒株被归为群 .

关键词：猪瘟病毒基因组克隆序列分析 GXWZ02株猪瘟

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南瓜蚜传黄化病毒基因组遗传多样性分析

西南农业学报 2022年第2期35卷 366-372页

作者：崔正秀孙柳清肖苗苗王燕飞罗永平赫娟玉山江·麦麦提陈伟山西师范大学生命科学学院山西临汾041000 新疆农业科学院乌鲁木齐830052

【目的】研究南瓜蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)的分子特征、遗传结构和进化机制,对于明确该病毒病在田间发生的流行规律和制定长期可持续的防控策略具有重要意义。【方法】从新疆阿克苏市随机采集了疑似感染... 详细信息

【目的】研究南瓜蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)的分子特征、遗传结构和进化机制,对于明确该病毒病在田间发生的流行规律和制定长期可持续的防控策略具有重要意义。【方法】从新疆阿克苏市随机采集了疑似感染CABYV的120份甜瓜叶片,采用RT-PCR方法进行病毒检测,序列采用MEGA 7.0构建系统发育树,使用DnaSP v5.10分析不同序列之间的遗传多样性,采用RDP v.4.31软件分析CABYV序列可能发生的重组事件。【结果】经RT-PCR验证,38个样品为CABYV阳性,检出率为31.67%。从这些阳性样品中分离、测序、克隆得到了一个新的CABYV-2分离物。该分离物基因组长度为5497 bp,编码6个开放阅读框。与NCBI数据库中的来自不同国家的23个CABYV分离物相比,CABYV-2与KR231942.1的同源性最高,与JF939812.1的同源性最低。进化树分析结果表明,24个分离物由于地理因素的不同被分为2个分支,其中CABYV-2与KR231942.1聚在一起,属于分支1。遗传多样性与中性检验结果说明CABYV存在高度变异且种群不断扩展。重组分析结果表明,有EU636992.1和KR231949.1两个重组事件,重组加剧了CABYV的变异。【结论】CABYV在我国分布广泛且种群不断扩展,成为瓜类植物生产的限制因素。CABYV新疆阿克苏市分离株与韩国分离株KR231942.1亲缘关系最近,与来自欧洲国家的分离株亲缘关系最远,分支1和分支2分离株之间存在较大的遗传差异,CABYV在不同宿主间的重组加剧了CABYV的变异,重组和负选择可能是影响CABYV遗传变异的重要原因。

关键词： CABYV 基因组克隆遗传多样性