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乳腺特异性共表达4种脂肪酸合成酶载体及其稳转山羊成纤维细胞系的构建

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安徽农业大学学报 2015年第3期42卷 417-423页

作者：潘开源陈建文陈真张明翔石恒波孙秀柱章孝荣张运海安徽地方畜禽遗传资源保护与生物育种省级实验室安徽农业大学动物科技学院合肥230036 安徽省羊繁育工程中心合肥230036 西北农林科技大学动物科技学院杨凌712100

为改善山羊乳品质,创制乳汁中富含n-3不饱和脂肪酸的奶山羊育种新材料,首先构建了一种山羊乳腺特异性表达载体,以实现n-3不饱和脂肪酸合通路中4种脂肪酸合成酶基因(fat-1,fads2,elovl5和scd-1)的共表达。为初步验证该载体的有效性,通过... 详细信息

为改善山羊乳品质,创制乳汁中富含n-3不饱和脂肪酸的奶山羊育种新材料,首先构建了一种山羊乳腺特异性表达载体,以实现n-3不饱和脂肪酸合通路中4种脂肪酸合成酶基因(fat-1,fads2,elovl5和scd-1)的共表达。为初步验证该载体的有效性,通过脂质体法转染小鼠乳腺上皮细胞系C127,经G418筛选收集阳性C127转基因细胞,并对其进行反转录PCR(RT-PCR)检测。结果表明,4种基因均可在C127细胞转基因中表达。将该多基因共表达载体转染奶山羊成纤维细胞,通过G418筛选获得了稳定转染的细胞系。PCR结果显示,4个目的基因均成功整合到奶山羊成纤维细胞基因组中。总之,本研究成功构建了乳腺特异性共表达4种脂肪酸合成酶转基因载体及其山羊转基因细胞系,为创制乳腺特异性表达多不饱和脂肪酸的转基因奶山羊奠定了基础。

关键词：山羊乳品质 n-3多不饱和脂肪酸多基因共表达载体

干扰TIP47基因对奶山羊乳腺上皮细胞脂滴形成及相关基因表达的影响

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农业生物技术学报 2017年第2期25卷 250-257页

作者：张倡珲郝娟罗军石恒波史怀平许会芬西北农林科技大学动物科技学院/陕西省农业分子生物学重点实验室浙江理工大学生命科学学院

47 k D尾部相互作用蛋白(tail-interacting protein 47,TIP47)在脂滴形成与代谢过程中具有重要调控作用,研究其在乳脂滴形成过程中的作用对调控羊(Capra hircus)乳品质具有重要意义。本研究采用BLOCK-i T小发夹RNA(short hairpin RNA,sh... 详细信息

47 k D尾部相互作用蛋白(tail-interacting protein 47,TIP47)在脂滴形成与代谢过程中具有重要调控作用,研究其在乳脂滴形成过程中的作用对调控羊(Capra hircus)乳品质具有重要意义。本研究采用BLOCK-i T小发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)腺病毒(Adenovirus)干扰系统,根据奶山羊TIP47基因序列,在线设计并合成干扰sh RNA。将有效sh RNA序列构建载体,并在293A细胞中包装腺病毒。利用腺病毒载体干扰乳腺上皮细胞TIP47基因表达后,检测胞内脂肪酸代谢基因及脂滴的变化。结果表明,筛选到有效sh RNA序列并获得高滴度TIP47基因的干扰腺病毒Ad-sh RNA-888。Ad-sh RNA-888感染山羊原代乳腺上皮细胞后发现,TIP47 m RNA表达量下调61%(P<0.01)。干扰TIP47基因的表达后,甘油三酯水解酶基因(adipose triglyceride lipase,ATGL)下调了15%,而脂肪酸合酶基因(fatty acid synthase,FASN)和激素敏感脂酶基因(hormone-sensitive lipase,HSL)分别上调1.77(P<0.05)和2.8(P<0.01)倍,硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(stearoyl-Co A desaturase,SCD)表达水平变化不显著。油红O结果显示干扰TIP47基因可以降低细胞脂滴(lipid droplets,LD)的形成。本研究对TIP47基因进行干扰,发现其在奶山羊乳腺细胞脂滴形成过程中有重要调控作用,为进一步研究TIP47基因对脂滴代谢的影响提供一定的理论依据。

关键词：奶山羊 47 kD尾部相互作用蛋白基因(TIP47) RNA干扰乳腺上皮细胞

罗格列酮影响山羊乳腺上皮细胞PPARγ基因活性

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罗格列酮影响山羊乳腺上皮细胞PPARγ基因活性

中国畜牧兽医学会2011年学术年会

作者：石恒波罗军李君许会芬西北农林科技大学动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室

引言PPARγ(过氧化物酶增殖激活受体γ,peroxisome proliferator-activated receptorγ)作为核转录因子和成脂因子一直是脂肪酸代谢调控研究热点,与脂肪细胞成熟分化及增殖等密切相关。PPARγ能够受特异性配体激活,通过有关信号通路影...

引言PPARγ(过氧化物酶增殖激活受体γ,peroxisome proliferator-activated receptorγ)作为核转录因子和成脂因子一直是脂肪酸代谢调控研究热点,与脂肪细胞成熟分化及增殖等密切相关。PPARγ能够受特异性配体激活,通过有关信号通路影响脂肪酸代谢及脂滴形成。山羊奶营养价值高,含有丰富的短链脂肪酸,关于山羊奶脂肪酸代谢基因调控机理的研究很少,目前尚未见到PPARγ基因调控泌乳过程中脂肪酸代谢的研究报道。本研究利用PPARγ基因特异性激动剂罗格列酮处理奶山羊乳腺上皮细胞观察其对有关基因表达的影响作用,为该基因功能研究提供参考。

关键词：

来源： cnki会议评论

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陕西不同地区不同泌乳时期奶山羊乳成分分析

家畜生态学报 2018年第5期39卷 52-55页

作者：朱江江罗军孙雨婷石恒波西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100 西南民族大学青藏高原研究院四川成都610041

试验旨在研究陕西三个不同地区不同泌乳时期的关中奶山羊乳常规营养成分的差异。选取健康,产奶量、体重及胎次接近的高产关中奶山羊139只(分别为凤翔县46只,淳化县50只,白水县43只)为研究对象,测定其乳脂率、乳蛋白、干物质、非脂固形... 详细信息

试验旨在研究陕西三个不同地区不同泌乳时期的关中奶山羊乳常规营养成分的差异。选取健康,产奶量、体重及胎次接近的高产关中奶山羊139只(分别为凤翔县46只,淳化县50只,白水县43只)为研究对象,测定其乳脂率、乳蛋白、干物质、非脂固形物及乳糖的含量,从而对不同地区和不同泌乳时期山羊乳常规营养成分的相对含量进行对比。结果表明:3个地区奶山羊乳中乳脂率、乳蛋白、干物质和非脂固形物的含量差异不显著(P>0.05)。随着泌乳时间的延长,各地区奶山羊乳中乳脂率、乳蛋白、干物质、非脂固形物均呈现出先下降后上升的趋势;乳中乳糖含量则随着泌乳时间的增加而呈现下降的趋势。这些结果对于统一不同地区羊奶的收购提供了一定的理论依据。

关键词：奶山羊不同地区泌乳期乳成分

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中国畜牧杂志 2014年第11期50卷 5-9页

作者：李芳罗军余康许会芬石恒波朱江江西北农林科技大学动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室陕西杨凌712100

在大肠杆菌中表达西农萨能羊脂肪分化相关蛋白(ADRP),并制备其多克隆抗体。以实验室保存的pMD19-T-ADRP质粒为模板,扩增ADRP的CDS区,将其克隆到pET32a(+)载体,阳性克隆转化到大肠杆菌菌株*** BL21(DE3)中诱导表达,优化融合蛋白表达条件... 详细信息

在大肠杆菌中表达西农萨能羊脂肪分化相关蛋白(ADRP),并制备其多克隆抗体。以实验室保存的pMD19-T-ADRP质粒为模板,扩增ADRP的CDS区,将其克隆到pET32a(+)载体,阳性克隆转化到大肠杆菌菌株*** BL21(DE3)中诱导表达,优化融合蛋白表达条件,使用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的ADRP蛋白经复性后免疫兔子制备多克隆抗体,ELISA和Western blot检测血清效价和特异性。结果表明:成功构建pET32a(+)-ADRP原核表达载体并诱导其表达,获得最佳表达条件,即37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h;ELISA检测显示抗体效价达1∶64 000;经Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能特异性结合原核表达以及乳腺上皮细胞表达的ADRP蛋白。本实验成功表达、纯化了ADRP融合蛋白,获得具高特异性、高效价的兔抗ADRP多克隆抗体。

关键词： ADRP 原核表达亲和纯化多克隆抗体羊

奶山羊过氧化物酶体增殖物激活受体基因(PPARγ)的克隆、表达及功能初步分析

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农业生物技术学报 2013年第9期21卷 1068-1075页

作者：石恒波罗军姚大为孙雨婷李君朱江江史怀平西北农林科技大学动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)在脂肪和糖代谢平衡中起重要作用。为研究奶山羊(Capra hircus)PPARγ基因在泌乳过程中的生理功能,本研究以西农萨能奶山羊乳腺组织为材料,利用RT-PCR... 详细信息

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)在脂肪和糖代谢平衡中起重要作用。为研究奶山羊(Capra hircus)PPARγ基因在泌乳过程中的生理功能,本研究以西农萨能奶山羊乳腺组织为材料,利用RT-PCR和RACE技术,克隆奶山羊PPARγ基因cDNA全长;利用荧光定量PCR检测该基因在奶山羊10个组织以及不同泌乳时期乳腺组织中的表达量;利用PPARγ特异性激动剂罗格列酮(rosiglitazone,ROSI)处理乳腺上皮细胞后,荧光定量PCR检测细胞内脂肪酸代谢相关基因的表达量。结果表明,奶山羊PPARγ基因cDNA序列全长为1 751 bp(GenBank登录号为:HQ589347);同源性分析发现,PPARγ基因在哺乳动物间有较强的保守性;结构预测表明,奶山羊PPARγ蛋白具有2个锌指结构以及配体结合域;组织表达谱分析显示,PPARγ基因在奶山羊的脂肪组织中表达量最高,其次是瘤胃,而肌肉组织表达量最少;奶山羊两个泌乳时期乳腺组织中PPARγ表达量分析表明,泌乳盛期的表达量约是干乳期的2倍。罗格列酮处理乳腺上皮后检测发现,细胞内脂肪酸代谢相关基因:脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)、脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein,FABP3)、脂肪分化相关蛋白(adipose differentiation related protein,ADRP)和47 kD尾部相互作用蛋白(47-kD tail interacting protein,TIP47)等表达量显著性上调。研究结果提示,PPARγ基因在奶山羊泌乳过程的脂肪酸代谢中可能其重要作用,为进一步研究奶山羊个体水平调控乳脂生成、改善乳脂品质和发挥乳腺生物反应器功能提供基础资料。

关键词：奶山羊 PPARγ基因组织表达脂肪酸代谢

miR-200家族在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达分析

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畜牧兽医学报 2013年第6期44卷 944-951页

作者：张犁苹罗军林先滋朱江江石恒波史怀平李君西北农林科技大学动物科技学院杨凌712100

笔者拟获得山羊miR-200家族乳腺组织表达谱,研究miR-200家族成员之间表达相关性及miR-200家族成员与山羊乳成分的相关性。通过定量PCR,检测miR-200家族在西农萨能奶山羊泌乳中期和干奶期乳腺组织中的表达量;利用Pearson相关系数分析miR-... 详细信息

笔者拟获得山羊miR-200家族乳腺组织表达谱,研究miR-200家族成员之间表达相关性及miR-200家族成员与山羊乳成分的相关性。通过定量PCR,检测miR-200家族在西农萨能奶山羊泌乳中期和干奶期乳腺组织中的表达量;利用Pearson相关系数分析miR-200家族不同成员表达量之间的相关性,同时分析miR-200家族成员与山羊乳成分之间的相关关系;利用miRanda和TargetScan 6.2软件分析、RNAhybrid和PITA软件预测miR-200家族的靶基因。结果表明,miR-200家族在奶山羊泌乳中期的乳腺组织中的表达量极显著高于干奶期(P<0.01);miR-200a与miR-141之间的表达量显著相关(P<0.05),miR-200b与miR-200c之间的表达量极显著相关(P<0.01);泌乳中期奶山羊乳腺组织中miR-200c的表达量与乳蛋白、非脂固形物(SNF)、冰点(FPD)的含量显著相关(P<0.05);经软件分析及预测发现,miR-200a/miR-141靶向作用于在乳脂合成中起关键作用的基因STAT4。miR-200家族可能对山羊乳蛋白及乳脂合成具有一定的调控作用。

关键词： miR-200家族西农萨能奶山羊乳腺组织表达靶基因

山羊脂肪酸合酶基因(FASN)启动子结构与功能的初步分析

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畜牧兽医学报 2012年第2期43卷 204-210页

作者：李君葛婷罗军孙雨婷石恒波朱江江郝娟赵旺生西北农林科技大学动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室杨凌712100 南京农业大学动物科技学院南京210095

本研究旨在对山羊脂肪酸合酶基因(Fatty acid synthase,FASN)启动子进行结构与功能的初步分析,进而对其转录调控机制进行探讨。采用PCR技术从西农萨能羊基因组DNA中克隆FASN基因启动子,通过缺失分析,构建7个包含不同缺失片段的荧光素酶... 详细信息

本研究旨在对山羊脂肪酸合酶基因(Fatty acid synthase,FASN)启动子进行结构与功能的初步分析,进而对其转录调控机制进行探讨。采用PCR技术从西农萨能羊基因组DNA中克隆FASN基因启动子,通过缺失分析,构建7个包含不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体,转染山羊乳腺上皮细胞和MCF-7细胞,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动活性。结果表明,克隆得到FASN基因的启动调控序列2 589bp,生物信息学分析发现,该启动子序列含有典型的启动转录元件TATA-box和E-box,分别位于转录起始位点(+1)上游-41和-74bp处。报告基因分析表明,启动子核心区域定位在-293～-79bp,在线软件预测发现,该区域含有Sp1、NF-Y、USF和SREBP等转录因子结合位点。结果显示,FASN基因启动子前端存在负调控元件,Sp1、NF-Y、USF和SREBP等转录因子可能参与FASN基因的转录调控。

关键词：山羊脂肪酸合酶启动子山羊乳腺上皮细胞

固醇调节元件结合蛋白SREBP-1促进山羊乳腺上皮细胞中脂肪酸及甘油三酯的合成

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固醇调节元件结合蛋白SREBP-1促进山羊乳腺上皮细胞中脂肪酸及甘...