检索结果-南通市图书馆

作者：岳菡雪广东财经大学

学位级别：硕士

“十四五”规划提出,城镇化是国家现代化的必由之路和重要标志。农民工作为建设城镇的重要力量,其社会保障水平向城镇人口靠拢是我国推进城镇化进程中重要的一部分。然而,由于我国长期存在的二元户籍制度,农民工的社会保障水平仍远低于... 详细信息

“十四五”规划提出,城镇化是国家现代化的必由之路和重要标志。农民工作为建设城镇的重要力量,其社会保障水平向城镇人口靠拢是我国推进城镇化进程中重要的一部分。然而,由于我国长期存在的二元户籍制度,农民工的社会保障水平仍远低于城镇职工。我国政府曾多次出台文件鼓励、促进农民工参保城镇职工基本医疗保险,但我国农民工的参保率仍处于较低水平。通过文献梳理可知,由于农民工自身流动性强、远离家乡,而城镇职工基本医疗保险存在转接手续复杂、统筹层次低、便携性较差等设计层面上的问题,许多农民工放弃参保城镇职工基本医保、保留新农合,以防后期返回流出地时保险关系产生转接续难的问题,而新农合对于流动范围更远的农民工来说无法从根本上破解其跨市、跨省医疗难题。流动范围似乎成为了影响农民工选择社会医疗保险的重要因素,基于此,本文以流动范围为切入点,探究农民工的流动范围如何影响其参保城镇职工基本医疗保险、以何种程度影响,对所得到的结论进行分析并提出相应对策。本文从2017年流动人口动态监测调查数据着手,将农民工按照流动范围分成跨省流动、省内跨市流动、市内跨县流动三群体进行研究。通过数据分析可知几乎80%的农民工在其流出地参保新农合、存在着人保分离的情况,跨省流动农民工参保城镇职工基本医疗保险的为18.65%比例最高,省内跨市流动农民工的参保率为17.77%,市内跨县流动的参保率最低,仅有11.03%,不同流动范围农民工参保率存在显著差异。为了着重研究流动范围与农民工参保情况有何关系,本文采用二元Logit进行回归分析,结果表明相对于市内跨县,跨省、省内跨市农民工的参保概率更高,跨省最高,且流动范围越广的农民工投保率越高,即工作场所转移影响了农民工对于的基本医疗保险的参与。为保证回归结果稳健性,本文使用倾向得分匹配法(PSM)进一步评估流动范围对农民工参保的影响,印证了Logit回归结果,得到了流动范围越大对于农民工参保城镇职工基本医疗保险的促进效果越明显的结论。最后根据本文实证结果提出以下建议:加大参保宣传力度,提高农民工参保意识;加强地区之间运行衔接、提高统筹层次,提升城镇职工基本医保的可携带性;完善医保信息平台建设,为农民工办理医保异地转接续提供便利。

关键词：农民工城镇职工基本医疗保险流动范围

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

多源轨迹数据时空聚类及居民出行模式分析

多源轨迹数据时空聚类及居民出行模式分析

作者：岳梦雪武汉大学

学位级别：硕士

公交车、地铁和出租车作为城市居民日常出行的主要公共交通工具,其轨迹数据和刷卡信息中蕴含着丰富的居民出行行为信息,通过对这些多元流数据进行挖掘,可发现居民出行的不同模式。居民出行模式挖掘的常用方法为聚类分析,而传统聚类方法... 详细信息

公交车、地铁和出租车作为城市居民日常出行的主要公共交通工具,其轨迹数据和刷卡信息中蕴含着丰富的居民出行行为信息,通过对这些多元流数据进行挖掘,可发现居民出行的不同模式。居民出行模式挖掘的常用方法为聚类分析,而传统聚类方法不适用于含有丰富时空信息的地理数据,因此,需要对传统方法进行时空扩展,以满足研究需要。本文以深圳市的出租车轨迹数据和公交车及地铁刷卡数据为实验数据集,通过不同区域内居民出行使用三种不同交通工具的数量和比例的统计,来探索性分析居民出行潜在的规律,然后利用基于邻接关系的时空谱聚类方法来挖掘具体的居民出行模式,并从交通工具的使用关系、社会背景和出行移动三个方面来理解和分析居民出行模式。本文的主要研究工作如下:(1)谱聚类方法的时空扩展谱聚类可对任意形状的样本空间进行聚类分析,且聚类结果能收敛于全局最优,具有很好的应用前景。本文对谱聚类方法的原理和离散化方法进行了总结性介绍,指出谱聚类算法的关键步骤为相似性矩阵的构建,通过分析传统谱聚类构造相似矩阵的方法,发现仅利用欧式空间距离度量时空轨迹的相似性具有很大的局限性,因此,提出一种同时考虑时间序列相似性和空间邻接距离的时空相似性矩阵的构造方法,从而实现谱聚类的时空扩展。(2)多源轨迹数据的时空谱聚类多源轨迹数据分别来自于不同的公共交通工具,记录了丰富的时空信息和居民出行规律,若将多源轨迹数据融合使用,并借助时空谱聚类方法,则可根据聚类分析结果来获取更多有价值的潜在信息。鉴于多源轨迹数据间的相互独立性,需要先根据各交通工具在居民出行中的实际使用情况,建立相同的度量标准,分别计算各交通工具的出行使用量占总出行量的比例,即可把多源轨迹数据信息化归到统一的比例度量体系下,再依次计算各交通方式条件下的时空相似性矩阵。最后结合图像处理领域彩色图像色彩合成原理,把三种交通数据类比成假彩色图像色彩空间中的三个不同维度(RGB)信息,并参考彩色图像灰度化的方法,实现多源轨迹数据时空相似性矩阵的融合,从而完成多源轨迹数据的时空谱聚类,为居民出行模式的挖掘奠定基础。(3)居民出行模式的挖掘与分析利用基于邻接距离的时空谱聚类方法,对多源轨迹数据进行时空聚类,通过对聚类结果的分析和挖掘,发现5种居民出行模式。为了更好地理解出行模式的特点,分别从不同模式下的交通工具使用关系、社会背景以及出行移动三个方面进行分析,从而发现在不同区域及居民出行模式下,公交车、地铁和出租车之间的运营竞争及协同合作关系,以及不同社会背景区域内的居民出行对交通工具的选择差异性,并结合出行移动情况,说明各出行模式在不同空间区域的互动关系。

关键词：公共交通工具多源轨迹数据居民出行模式时空相似性时空谱聚类

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

刘阮遇仙故事源流研究

刘阮遇仙故事源流研究

作者：岳玉雪黑龙江大学

学位级别：硕士

刘晨、阮肇在天台山偶然遇见仙女的故事最早出现在南朝时期宋刘义庆的《幽明录·刘晨阮肇》中,汉魏晋时期的一些神仙传记中已有与刘阮遇仙相类似的故事,唐宋时期的诗词中将刘阮遇仙作为典故使用,元明清时期刘阮故事又被戏曲家们演绎为... 详细信息

刘晨、阮肇在天台山偶然遇见仙女的故事最早出现在南朝时期宋刘义庆的《幽明录·刘晨阮肇》中,汉魏晋时期的一些神仙传记中已有与刘阮遇仙相类似的故事,唐宋时期的诗词中将刘阮遇仙作为典故使用,元明清时期刘阮故事又被戏曲家们演绎为场上之曲,经过历代文人墨客的不断书写,刘阮传说已然超越了最初的故事内涵,拓展出一个个更加广阔的文学空间。元杂剧中演绎刘阮遇仙故事的作品有马致远的《晋刘阮误入桃源》、汪元亨的《桃源洞》、陈伯将的《晋刘阮误入桃源》,惜均已失传。明代王子一的四折杂剧《刘晨阮肇误入桃源》是刘阮遇仙故事的典范之作,万历间尚有杨之炯的一折杂剧《天台奇遇》。在明清传奇戏曲中,今存清人张匀的《长生乐》。此外,在清代子弟书和近现代戏曲中,也有一些演绎刘阮遇仙题材的作品。刘阮故事在传播的过程中逐渐与陶渊明笔下的“桃花源”合流,“桃源仙境”成为后世刘阮故事中固定的背景,原因在于《桃花源记》与《刘晨阮肇》故事的相似性。刘阮故事的产生便伴随着道教思想的传播,在后世的刘阮故事中也有道教思想的渗透,探究各个时期刘阮故事中的道教思想,对深入挖掘文人心态和作家环境有所帮助。目前学界对刘阮遇仙题材的研究尚呈片段、零散的态势,缺少由源及流的全面系统的研究。通过对刘阮遇仙故事的整体研究,既有助于对该故事的源流演变作整体透视,也有助于对明清戏曲文学生态做深入探讨,对该题材的系统研究与个案开掘都有所裨益。

关键词：刘晨阮肇《误入桃源》《天台奇遇》《长生乐》

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

丁苯酞减轻脓毒症小鼠脑损伤

丁苯酞减轻脓毒症小鼠脑损伤

作者：岳天雪锦州医科大学

学位级别：硕士

目的丁苯酞对脓毒症小鼠是否具有脑保护作用。方法健康成年雄性C57BL/6小鼠70只,随机分3组,假手术组(Sham组)10只;脓毒症组(CLP组),脓毒症+NBP组(NBP组),各30只。CLP或假手术前3天所有小鼠连续每日进行Morris水迷宫(MWM)获得性训练,手... 详细信息

目的丁苯酞对脓毒症小鼠是否具有脑保护作用。方法健康成年雄性C57BL/6小鼠70只,随机分3组,假手术组(Sham组)10只;脓毒症组(CLP组),脓毒症+NBP组(NBP组),各30只。CLP或假手术前3天所有小鼠连续每日进行Morris水迷宫(MWM)获得性训练,手术当天于手术前行隐匿平台测试及探查测试;建模;CLP或假手术后6小时,给予NBP组小鼠鼻饲丁苯酞70mg/kg/d,Sham组及CLP组鼻饲等体积植物油;连续7天记录各组小鼠一般情况及死亡数,以计算病死率;各组小鼠于手术前、术后第4天及7天进行神经反射评估;CLP或假手术后24小时取各组存活小鼠5只灌注取材,取海马匀浆后行氧化应激及炎症指标检测;各组存活小鼠于假手术或CLP术后第4天及第7天进行Morris水迷宫(MWM)隐匿平台测试及探查测试。MWM后即刻对各组存活小鼠灌注并取海马组织,左侧行HE染色,右侧行凋亡细胞测定。结果1、行CLP或假手术后24小时Sham组小鼠无死亡,CLP组小鼠死亡5只,NBP组小鼠死亡4只,CLP组与NBP组死亡率为83.3%vs 86.6%(P=1.00),两组死亡率无统计学差异。术后第4天,Sham组小鼠无死亡,CLP组小鼠共死亡15只,NBP组小鼠共死亡10只(注:以上死亡小鼠均不包含24小时用于氧化应激和炎症因子测定的小鼠),CLP组与NBP组小鼠死亡率为(60.0% vs 40.0%,P<0.05)。术后第7天,Sham组小鼠无死亡,CLP组小鼠共死亡19只,NBP组小鼠共死亡10只,CLP组与NBP组死亡率76.0% vs 40%(P<0.05),存在统计学差异。Kaplan-Meier分析小鼠生存时间提示Sham组与CLP组间存在差异(P<0.05),CLP组和NBP组间存在差异(P<0.05),Sham组与NBP组间均存在差异(P<0.05)。2、相较于Sham组,CLP组SOD及MDA浓度明显升高,有统计学意义(P<0.05);TNF-α及IL-6浓度明显升高,有统计学差异(P<0.05)。NBP组与CLP组相比,SOD及MDA浓度较低,有统计学差异(P<0.05),TNF-α及IL-6浓度均较低,有统计学差异(P<0.05);但NBP组与Sham组相比,SOD、MDA、TNF-α及IL-6浓度较高,且均有统计学差异(P<0.05)。3、术后24小时,CLP组及NBP组神经反射评估得分较Sham组明显下降,两组与Sham组相较均存在统计学差异(P<0.05),虽NBP组得分略高于CLP组,但两组相较无统计学差异(P=0.108)。术后第4天,CLP组及NBP组神经反射评分仍低于Sham组,两组与Sham组得分相较均存在统计学差异(P<0.05);NBP组得分高于CLP组,但CLP组与NBP组神经反射评分无统计学差异(P=0.11);术后第7天,CLP组及NBP组评分与Sham组相比仍较低,两组与Sham组得分相比仍存在统计学差异(P<0.05);NBP组得分高于CLP组,且两组得分相较存在统计学差异(P<0.05)。4、手术当天各组小鼠逃避潜伏时间、进入目标象限比例及进入目标象限次数未见统计学差异;术后第4天,相较于Sham组,CLP组和NBP组逃避潜伏时间明显延长、进入目标象限比例及次数明显下降,且两组与Sham组相比存在统计学差异(P<0.05)。NBP组较CLP组潜伏时间延长幅度及进入目前象限比例及次数下降幅度均较小,存在统计学差异(P<0.05);术后第7天,相较于Sham组,CLP组逃避潜伏时间仍有延长、进入目标象限比例及次数仍有下降,存在统计学差异(P<0.05);但较其术后第4天表现有所好转,存在统计学差异(P<0.05)。NBP组避潜伏时间、进入目标象限比例及次数较第4天表现明显好转,且与Sham组相比,不存在统计学差异(P=0.681)。5、光镜下可见Sham组小鼠海马区神经元及胶质细胞大小正常,细胞结构清晰;CLP组小鼠可见神经元细胞核固缩、深染,神经元胞质水肿,间质水肿;NBP组同样可见神经元固缩深染,周围组织水肿,但程度较CLP组较轻。6、Sham组在蓝色背景下可见少量绿色荧光显现,CLP组较Sham组绿色荧光显现明显增多,NBP组绿色荧光显现较Sham组增多,但较CLP组减少。结论丁苯酞能够降低脓毒症小鼠海马区炎症因子的水平及氧化应激反应的程度,可减少神经元的凋亡,改善小鼠的空间记忆障碍,降低小鼠的远期死亡率。

关键词：脓毒症脓毒症相关性脑病丁苯酞炎症因子氧化应激细胞凋亡

近代上海水域的“水上人”初探——以艒艒船户为中心

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

近代上海水域的“水上人”初探——以艒艒船户为中心

作者：岳霄雪上海社会科学院

学位级别：硕士

上海地区水网密布,20世纪中期,各国租界先后建立,吸引了大量人口,促进了租界内的繁荣,而这种繁荣又不断吸引更多的人来沪寻求生存机会。租界之陆地管理虽属各国,但水域之管理权仍属中国,这种特殊时期下特殊的水陆两地权责不一的情况,使... 详细信息

上海地区水网密布,20世纪中期,各国租界先后建立,吸引了大量人口,促进了租界内的繁荣,而这种繁荣又不断吸引更多的人来沪寻求生存机会。租界之陆地管理虽属各国,但水域之管理权仍属中国,这种特殊时期下特殊的水陆两地权责不一的情况,使得苏州河与黄浦江及其沿江河之之港、浜、径、塘等条支流所构成的水网区域之管理权责不明,实际操作上复杂万分。这一特殊的情况,给了周边希图来沪寻求生存机会之人以方便,吸引了大量人员操舟由水来沪,这些人所谋职业各不相同,多以船为家或以船为生,正是这些“水上”人员组成了复杂的水上社会。艒艒船户作为一个特殊的水上群体,他们浮家泛宅,生活在船上而谋生在陆上。艒艒船户多是上海周边的农民,在原籍依靠土地生产生活,撑船来到上海之后,在上海的全部财产便是一叶小舟,转变为了水上居民,这种身份上的转变与地理空间上的变化密切相关。特殊的生活方式使得艒艒船户与水上和陆上的主流社会冲突不断,这些冲突主要集中在治安、卫生、生活空间与水上商业秩序这几个方面,这种冲突本质上是“客籍”与主流,非常态与常态之间的矛盾。艒艒船户被排除在正常的社会秩序之外,成为了底层人群中的边缘群体。随着艒艒船户群体的不断扩大,与水陆联系不断加深,矛盾冲突愈发复杂,上海政府对于艒艒船户的了解也逐步加深,在管理手段上经历了从无到有,从简单驱逐到系统管理的过程。针对上海地区的艒艒船户研究,对于上海近代化城市化进程的研究是一个新的人群切入点,由艒艒船户群体的形成、发展变化状态、与陆上居民的矛盾、交融,体现了近代上海中外矛盾、城乡矛盾、传统与现代矛盾交织的特殊历史状况,同时也对上海底层群体生活状态与治理方式的研究有更进一步的补充与丰富。

关键词：上海水网水上人艒艒船

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

全面增强党的执政本领八讲

2018年

作者：刘炳香岳宗强

党的十九大报告首次提出“全面增强执政本领”，本书从“全面增强党的执政本领的内涵是什么，为什么要全面增强党的执政本领以及如何全面增强党的执政本领”三个重要内容入手，对全面增强党的执政本领的重要性紧迫性、把握全面增强党的... 详细信息

ISBN: (纸本)9787218129990

党的十九大报告首次提出“全面增强执政本领”，本书从“全面增强党的执政本领的内涵是什么，为什么要全面增强党的执政本领以及如何全面增强党的执政本领”三个重要内容入手，对全面增强党的执政本领的重要性紧迫性、把握全面增强党的执政本领的基本规范以及找准增强党的执政本领的着力点等基本问题作了全面而系统的阐述。

关键词：中国共产党执政研究

来源：汇雅图书（南通市图书馆... 评论

在线全文

汇雅图书（南通市图书馆）

学校读者我要写书评

暂无评论

带记忆项的粘弹性方程解的能量衰减估计

带记忆项的粘弹性方程解的能量衰减估计

作者：岳香英四川师范大学

学位级别：硕士

本文研究了一类带有记忆核的粘弹性方程解的能量衰减估计和一类含有阻尼项及粘弹性项的波动方程解的能量衰减估计.本文共分为四个部分:第一部分介绍了粘弹性波动方程的意义及其主要成果.第二部分介绍了本文所涉及到的一些空间、定义及... 详细信息

本文研究了一类带有记忆核的粘弹性方程解的能量衰减估计和一类含有阻尼项及粘弹性项的波动方程解的能量衰减估计.本文共分为四个部分:第一部分介绍了粘弹性波动方程的意义及其主要成果.第二部分介绍了本文所涉及到的一些空间、定义及不等式.第三部分研究了一类带有非退化记忆核的粘弹性系统解的能量衰减问题,通过构造合适的辅助函数,以及运用相应的不等式,证明了该类粘弹性方程的衰减方式.第四部分研究了一类带有变系数阻尼项及粘弹性项的波动方程解的能量衰减问题,研究了波在包含了弹性及粘弹性两种不同材料物体上的的传播问题,证明了在一定条件下,一类波动方程中同时含有变系数阻尼项及粘弹性项时,该类波动方程呈指数衰减或多项式衰减都是特殊的衰减方式.

关键词：粘弹性方程波动方程记忆核非退化传输问题阻尼项能量衰减估计

供应链协同创新对企业战略绩效的影响研究——以京东为例

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

供应链协同创新对企业战略绩效的影响研究——以京东为例

作者：岳香彤内蒙古大学

学位级别：硕士

随着经济发展提速,市场和社会环境的变化也越来越快,市场竞争压力逐渐增多,企业由于资源或者能力上的短板,仅依靠自身实力难以应对社会经济环境的冲击,对此,企业可以选择协同合作的方式补齐相互之间的短板,提高竞争力;除了合作共赢,资... 详细信息

随着经济发展提速,市场和社会环境的变化也越来越快,市场竞争压力逐渐增多,企业由于资源或者能力上的短板,仅依靠自身实力难以应对社会经济环境的冲击,对此,企业可以选择协同合作的方式补齐相互之间的短板,提高竞争力;除了合作共赢,资源与技术的迅速更新,使得企业在动态复杂的市场环境下,既要借助外力,又要开发自身,此时创新便成为企业选择方案之一。基于此,供应链协同创新成为企业增强竞争优势、提升战略绩效的有效方案之一。采用案例研究法,以系统理论、集成理论和创新理论为指导,选取京东公司为研究对象,从内容维度:知识、技术和管理以及主体维度:供应商、客户和内部跨部门两个维度、六项内容分析京东供应链协同创新效应,通过分析合作双方的协同创新方式以及对企业战略绩效的影响路径,最终对协同创新效果评价分析,并得出以下相关研究结论:1.内容维度的供应链协同创新,即供应链协同知识、技术、管理创新,都能够显著地增强财务绩效、维护客户关系以及提升学习与成长能力,促进收入与利润增长,降低履约费用率,实现企业降本增效,进而促进战略绩效提升,但不能够正向优化企业内部流程,主要由于内容维度的知识、技术、管理仅针对供应链某一环节的绩效表现,而优化内部流程则涉及整个供应链环节的绩效评价,二者无法完全契合;2.主体维度的供应链协同创新,即上游供应商、下游客户、内部跨部门参与供应链协同创新,对平衡计分卡所衡量的战略绩效均产生正向效应,其能够促进企业整合上下游优势,提升企业市场占有率、增加收入、并整合企业内部资源以减少不必要的竞争,从而不断提高供应链效率,提升企业战略绩效。研究结论在丰富供应链协同创新以及战略绩效相关理论的同时,也提升了企业供应链管理水平,保障供应链高质量可持续发展。

关键词：协同创新价值创造平衡计分卡京东

美国桂花（osmanthus americanus）种子休眠机理的研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

美国桂花（osmanthus americanus）种子休眠机理的研究

作者：许岳香南京林业大学

学位级别：硕士

在自然状态下,美国桂花种子具有休眠现象,本研究对美国桂花种子的休眠原因、休眠机理以及解除休眠的方法进行了研究,结果表明:1.在光照条件下对美国桂花离体胚进行培养,其发芽率达100%,而完整种子、去除种壳的种子的发芽率都为0%。剥除... 详细信息

在自然状态下,美国桂花种子具有休眠现象,本研究对美国桂花种子的休眠原因、休眠机理以及解除休眠的方法进行了研究,结果表明:1.在光照条件下对美国桂花离体胚进行培养,其发芽率达100%,而完整种子、去除种壳的种子的发芽率都为0%。剥除胚根端胚乳的种子在恒温光照条件下培养14d就能顺利萌发;剥除子叶端胚乳的种子在相同的条件下培养7d露出的部分子叶开始变绿,到14d时子叶开始展开,并且胚根端出现裂口;而未剥除任何胚乳的完整种子未见有任何萌动的迹象。这说明美国桂花种子胚乳的机械作用是造成种子休眠的主要原因。2.美国桂花种壳外表面有不规则的褶皱,种壳纵剖面中有许多种孔,这些结构能够有效地保障种胚生长发育过程中的水气交换。因此,种壳不是导致休眠的主要原因。3.美国桂花种子胚乳中内含物透射观察发现,随着层积时间的延长,细胞膜逐渐解体、到后期淀粉、脂粒大量出现。这表明,在低温层积过程中胚乳中营养物质不断分解,为种子萌发生长提供所需的物质和能量。4.在本研究中,去种壳+赤霉素处理+赤霉素拌沙低温层积对解除美国桂花种子的休眠最为有效,在处理后45d能使种子的发芽率达到74%。

关键词：美国桂花休眠原因休眠机理低温层积赤霉素

石斛碱激活Nrf2/Keap1通路抗过氧化氢诱导的人角质形成细胞氧化损伤的研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

石斛碱激活Nrf2/Keap1通路抗过氧化氢诱导的人角质形成细胞氧化损...

作者：岳齐香遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:观察金钗石斛碱(dendrobine,Dendr)抗过氧化氢诱导的人角质形成细胞氧化损伤的作用,并通过Nrf2/Keap1信号通路探讨其作用机制,旨在为将金钗石斛开发成为一种具有抗氧化功能的产品提供实验依据。方法:体外培养人源性角质形成细胞株(... 详细信息

目的:观察金钗石斛碱(dendrobine,Dendr)抗过氧化氢诱导的人角质形成细胞氧化损伤的作用,并通过Nrf2/Keap1信号通路探讨其作用机制,旨在为将金钗石斛开发成为一种具有抗氧化功能的产品提供实验依据。方法:体外培养人源性角质形成细胞株(keratinocyte,HACAT),首先对石斛碱和HO的浓度进行筛选,分组(1):石斛碱(0,0.01,0.1,1,10,100μM);分组(2):HO(0,100,200,400,800μM);分别给予相应浓度的石斛碱和HO作用24 h后,通过MTT法检测细胞活力,确定后续实验中石斛碱和HO的浓度。继而观察石斛碱对HO诱导的细胞毒性作用;分组(3):空白对照组,空白+石斛碱1μM组,HO组,HO+石斛碱0.01μM组,HO+石斛碱0.1μM组,HO+石斛碱1μM组,HO+阳性药维生素E 50μM组;预先给予石斛碱作用12 h,再给予HO处理24 h,处理结束后分别采用MTT法和LDH试剂盒检测细胞活力及LDH漏出率;通过光学显微镜观察HACAT细胞形态的改变。进一步检测石斛碱对HO诱导的细胞氧化应激及凋亡水平的影响。分组同(3),活性氧(ROS)荧光定量试剂盒检测细胞中ROS水平;酶活性试剂盒检测细胞中乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)的活性及丙二醇(MDA)含量;实时荧光定量PCR(RT-q PCR)以及Western blot检测CAT和GSH-Px的m RNA水平及蛋白表达情况。TUNEL法检测细胞凋亡水平;Western blot检测Bax、Bcl-2、细胞色素C(cyto C)的蛋白表达及cleaved-Caspase 9和cleaved-Caspase 3的蛋白水平。最后通过Nrf2/Keap1信号通路探讨石斛碱的作用机制,观察Nrf2/Keap1信号通路关键分子的变化情况。分组同(3),免疫荧光染色和Western blot检测核因子E2相关因子2(Nrf2)的细胞核转位情况;Western blot及RT-q PCR检测Nrf2、Keap1、血红素加氧酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)蛋白的表达和m RNA水平。再沉默Nrf2探讨石斛碱的作用,分组(4):si-Control组、si-Control+HO组、si-Control+HO+石斛碱组、si-Nrf2+HO组、si-Nrf2+HO+石斛碱组;转染Nrf2-si RNA 24 h后,给予石斛碱作用12 h,再孵育HO24 h,处理结束后MTT法检测细胞活力;LDH试剂盒检测LDH漏出率;Western blot检测Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1、SOD2、CAT、Bax及Bcl-2蛋白表达的影响。结果:浓度筛选结果表明石斛碱的浓度不超过1μM时没有影响细胞活力;HO浓度为400μM时,细胞活力降低至65%左右;因此,后续实验选择0.01,0.1及1μM的石斛碱和400μM的HO。石斛碱对HO诱导细胞毒性作用的结果显示:HO导致细胞活力下降、LDH升高,细胞变圆、体积变小、排列稀疏且紊乱;不同浓度石斛碱预处理后提高了细胞活力、降低了LDH漏出率,并使细胞体积和形状均接近正常细胞。细胞氧化应激及凋亡的结果显示:HO引起HACAT细胞中ROS和MDA含量增加,经石斛碱预处理后ROS和MDA含量显著减少;HO降低了SOD、CAT及GSH-Px的活性,石斛碱则明显抑制了抗氧化酶活性水平的下降。HO导致HACAT的细胞凋亡,石斛碱预处理之后抑制了细胞凋亡,调节了凋亡相关蛋白的表达,包括降低了Bax、cyto C的蛋白表达和cleaved-Caspase 9及cleaved-Caspase 3的蛋白水平,提高了Bcl-2的蛋白表达。通过Nrf2/Keap1信号通路探讨石斛碱作用的结果显示:在HO的刺激下石斛碱促进Nrf2向核内转位;还降低Keap1蛋白及m RNA的表达,升高HO-1和NQO1蛋白表达及m RNA的水平。Nrf2基因的沉默效率显示转染浓度为60 n M时,Nrf2蛋白表达水平减低了约70%,因此后续实验采用60 n M作为沉默Nrf2的浓度。Nrf2沉默之后,再给HO处理,细胞活力下降更为明显,给予石斛碱后细胞活力下降的状态也未改善;并且石斛碱对Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1、SOD2、CAT、Bax及Bcl-2蛋白的调节作用也受到了抑制。结论:金钗石斛碱抑制HO诱导的HACAT细胞毒性,降低氧化应激及细胞凋亡水平,其作用机制与石斛碱激活Nrf2/Keap1信号通路及调节抗氧化酶活性相关。

关键词：石斛碱人角质形成细胞氧化应激细胞凋亡核红细胞2相关因子