基于自组装多肽的血小板3D储存及其抗损伤机制研究

作     者：祁凤英 

作者单位：天津科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：梁俊;焦庆玲

授予年度：2023年

学科分类：08[工学] 080501[工学-材料物理与化学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 080502[工学-材料学] 

主      题：自组装多肽 血小板 3D储存 储存损伤 线粒体功能 抗凋亡 

摘      要：受储存损伤及细菌污染的双重影响,临床22±2℃振荡储存血小板有效保质期仅为5-7天。目前大多数用于抑制血小板黏附与活化的血小板储存袋材料尚未进行整个储存期内血小板的质量和功能评估。而自组装多肽材料易于设计与合成,具有良好的生物相容性,其纤维网络结构可以模拟细胞外基质,已被广泛用于改善细胞体外生存微环境。课题组前期基于自组装多肽材料实现了22±2℃非振荡条件下血小板储存,可在储存初期显著降低血小板凋亡率,有效减轻非振荡条件下血小板储存损伤,并且便于血小板远程运输,但储存后期的血小板质量有待于进一步提高,具体抗损伤机制也尚未明确。因此,进一步基于改进序列的自组装多肽材料提高非振荡条件下血小板储存质量,并探究其抗损伤机制是本研究的重要目的。 首先,本研究评价了改进序列的自组装多肽材料性能及其对血小板质量的影响:溶血率和流变力学检测结果证实优化后自组装多肽材料具有良好的血液相容性,其交联密度与多肽浓度相关;通过透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)及激光共聚焦显微镜进行微观结构及立体观察,结果表明多肽材料自组装后通过形成长纳米纤维相互交错的致密网络结构实现血小板3D分布,可减少储存过程中血小板沉积;随后,明确0.05 wt%为自组装多肽材料储存血小板的最佳浓度,与常规22±2℃振荡组(2D振荡组)相比较,在血小板储存期内,3D组血小板凋亡率显著降低,典型的圆盘形血小板居多,储存后期(5天)血小板数目、活化水平及聚集功能均无统计学差异。 进一步,本研究探索了基于改进序列自组装多肽材料的血小板3D储存抗损伤机制,具体内容如下: 1)基于自组装多肽的血小板3D储存有利于维持线粒体功能 线粒体对无核血小板的生理功能及生物活性具有重要作用。为了明确基于自组装多肽的3D储存对血小板线粒体功能的影响,本研究观察血小板线粒体形态并检测线粒体膜电位(ΔΨm)与活性氧(ROS)水平。首先,TEM观察结果显示:储存2天后,3D组血小板线粒体基质未明显变淡,嵴走向清晰,线粒体内外膜完整,表明3D储存有利于维持血小板线粒体的正常形态。随后,流式细胞术检测结果表明,储存5天后,与2D振荡组、2D静置组相比较,3D组血小板线粒体去极化水平均显著降低,3D储存有利于维持血小板ΔΨm水平。此外,利用Mito SOX Red和DCFH-DA探针分别检测线粒体内及胞内ROS水平变化,结果发现,与2D振荡组相比,储存2天后,3D组血小板线粒体内及胞内ROS水平均显著降低;储存5天后,3D组血小板线粒体内及胞内ROS与2D振荡组均无统计学差异,而3D组胞内ROS水平显著低于2D静置组,提示3D储存可有效维持血小板抗氧化应激能力。以上结果证实,基于自组装多肽的血小板3D储存有利于维持线粒体功能。 2)基于自组装多肽的3D储存有效维持葡萄糖代谢 无核血小板在代谢方面非常活跃,其代谢系统主要通过无氧糖酵解和氧化磷酸化供能。血小板中葡萄糖(Glu)代谢主要通过无氧糖酵解产生乳酸(Lac),乳酸脱氢酶(LDH)是此过程的关键酶。此外,葡萄糖代谢产生的丙酮酸可在丙酮酸脱氢酶(PDH)催化作用下生成乙酰Co A,并为血小板提供能量。生化分析结果显示:Glu含量与p H随储存时间延长呈进行性降低,Lac及LDH含量呈进行性增加;与2D振荡组相比较,3D储存5天内血小板胞外的Glu含量均显著降低,提示3D储存葡萄糖代谢更活跃。储存2天后,3D组Lac释放量显著增高,胞外LDH释放显著降低,表明3D储存糖酵解水平较高,可有效减少血小板细胞膜破裂,与血小板形态观察结果相一致。此外,ELISA检测血小板内PDH含量结果表明,与2D振荡组、2D静置组相比较,储存2天、3天及5天后,3D组血小板内PDH含量均显著降低,提示3D储存TCA循环更活跃,可能更有利于血小板产生更多能量维持其功能。 3)基于自组装多肽的3D储存降低线粒体依赖凋亡相关蛋白表达 以线粒体为中心的凋亡途径调控血小板的寿命。前期实验结果表明基于自组装多肽的3D储存可显著降低储存期间血小板凋亡率,为进一步探究基于自组装多肽的3D储存对血小板线粒体依赖的内在凋亡的影响,明确3D储存抗凋亡机制,本研究通过western blot检测血小板3D储存期间线粒体依赖的内在凋亡信号通路相关蛋白的表达情况。结果显示,储存期间各组的细胞色素c(Cyto c)表达水平随时间延长而增加;与2D振荡组、2D静置组相比较,储存2天后,3D组Cyto c与Caspase 9蛋白表达水平均显著降低,提示3D储存可有效减轻线粒体膜损伤,降低线粒体依赖凋亡相关蛋白Cyto c的释放与Caspase 9的激活以降低血小板凋亡率。 综上所述,本研究基于改进序列的自组装多肽材料,进一步提高了22±2℃非振荡