TXNRD1调控Cysteine缺乏诱导CML细胞铁死亡的作用及其机制研究

作     者：刘书涵 

作者单位：福建医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：林东红

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：TXNRD1 Cysteine缺乏 铁死亡 CML 

摘      要：目的:1明确Cysteine缺乏诱导CML细胞铁死亡的作用。2筛查参与Cysteine缺乏诱导CML细胞铁死亡调控的关键基因,明确关键基因对CML细胞铁死亡的影响及相关信号通路。3动物体内验证关键基因调控CML细胞铁死亡的作用及其相关通路。方法:1采用MTS法检测Cysteine缺乏后CML细胞的增殖能力,明确细胞死亡形式,分析铁死亡敏感性;TEM观察线粒体超微结构、FCM检测脂质ROS水平、微量法检测MDA水平,明确Cysteine缺乏对CML细胞铁死亡的诱导作用;同时检测GSH含量和GPX4活性变化,探讨Cysteine缺乏诱导铁死亡的相关信号通路。2 RNA-Seq筛选CML细胞中参与Cysteine缺乏诱导铁死亡的关键基因,KEGG分析关键基因调控Cysteine缺乏诱导的CML细胞铁死亡的相关信号通路,q RT-PCR、Western blot验证关键基因表达变化。3构建干扰关键基因的慢病毒载体,嘌呤霉素筛选稳转株,q RT-PCR和Western blot鉴定下调效果,检测铁死亡相关指标,明确关键基因下调对Cysteine缺乏诱导的CML细胞铁死亡的影响;并用抑制剂加以验证。q RT-PCR、Western blot检测通路相关分子表达变化。4构建关键基因下调的CML细胞皮下瘤小鼠模型并鉴定,采用Cysteine缺乏饲料喂养,微量法检测瘤体Cysteine浓度变化;观察CML小鼠体重及皮下瘤体积、瘤体铁死亡超微结构变化;检测脂质ROS、MDA水平及铁死亡通路相关分子PTGS2、Tf R1、GSH和GPX4水平变化。结果:1 Cysteine缺乏后K562/G01细胞增殖能力明显下降且仅被铁死亡抑制剂Fer-1逆转(P0.001),其线粒体出现铁死亡特征性超微结构变化、ROS和MDA水平均明显升高(P0.01),而上述结果未见于K562细胞。两株CML细胞Cysteine缺乏后GSH含量和GPX4酶活性均下降(P0.001)。2 RNA-Seq筛查发现Cysteine缺乏后K562/G01细胞中与氧化还原密切相关的TXNRD1基因显著上调,KEGG分析显示TXNRD1可通过NRF2抗氧化信号通路影响细胞增殖。经q RT-PCR和Western blot验证,TXNRD1基因表达在K562/G01中显著上调(P0.01)而在K562细胞中无明显变化,其酶活性在K562/G01细胞中降低(P0.001),但在K562细胞中却无变化。3成功构建TXNRD1下调的慢病毒载体并感染K562细胞,嘌呤霉素筛选出稳转株,q RT-PCR和Western blot验证K562细胞中TXNRD1明显下调且酶活性下降(P0.01)。Cysteine缺乏后,与NC组相比,TXNRD1 sh RNA组的细胞活力显著降低(P0.01),可被Fer-1逆转(P0.01);TEM可观察到细胞线粒体嵴减少且外膜破裂,细胞质中存在大量脂滴;脂质ROS和MDA水平升高(P0.01)。TXNRD1抑制剂处理同样可使K562细胞在Cysteine缺乏后出现铁死亡。4 TXNRD1稳定下调的K562细胞在Cysteine缺乏后NRF2、HMOX1和NQO1的m RNA和蛋白水平均升高,且NRF2蛋白入核增加(P0.05)。5成功建立TXNRD1下调的CML皮下瘤小鼠模型,经瑞氏和HE染色可观察到小鼠皮下瘤CML细胞典型形态学特征和人CD45阳性;Cysteine缺乏饲料喂养14天后,CML小鼠瘤体细胞中Cysteine浓度明显降低(P0.01);TXNRD1下调的小鼠皮下瘤体积明显减小,且出现铁死亡特异性超微结构变化,ROS和MDA水平均升高(P0.01),PTGS2和Tf R1的m RNA和蛋白表达水平均升高(P0.05),而GSH含量、GPX4及TXNRD1酶活性均明显降低(P0.01),通路相关分子NRF2、HMOX1和NQO1的m RNA和蛋白水平均升高,且NRF2蛋白入核增加(P0.05)。结论:1 Cysteine缺乏可诱导CML细胞铁死亡,且不同CML细胞敏感性不同;2 TXNRD1是调控体内、外Cysteine缺乏诱导的CML细胞铁死亡发生的关键基因;3 TXNRD1调控Cysteine缺乏诱导CML细胞铁死亡的发生与NRF2抗氧化信号通路密切相关。