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txnrd1调控Cysteine缺乏诱导CML细胞铁死亡的作用及其机制研究

TXNRD1调控Cysteine缺乏诱导CML细胞铁死亡的作用及其机制研究

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作者：刘书涵福建医科大学

学位级别：硕士

目的:1明确Cysteine缺乏诱导CML细胞铁死亡的作用。2筛查参与Cysteine缺乏诱导CML细胞铁死亡调控的关键基因,明确关键基因对CML细胞铁死亡的影响及相关信号通路。3动物体内验证关键基因调控CML细胞铁死亡的作用及其相关通路。方法:1采用... 详细信息

目的:1明确Cysteine缺乏诱导CML细胞铁死亡的作用。2筛查参与Cysteine缺乏诱导CML细胞铁死亡调控的关键基因,明确关键基因对CML细胞铁死亡的影响及相关信号通路。3动物体内验证关键基因调控CML细胞铁死亡的作用及其相关通路。方法:1采用MTS法检测Cysteine缺乏后CML细胞的增殖能力,明确细胞死亡形式,分析铁死亡敏感性;TEM观察线粒体超微结构、FCM检测脂质ROS水平、微量法检测MDA水平,明确Cysteine缺乏对CML细胞铁死亡的诱导作用;同时检测GSH含量和GPX4活性变化,探讨Cysteine缺乏诱导铁死亡的相关信号通路。2 RNA-Seq筛选CML细胞中参与Cysteine缺乏诱导铁死亡的关键基因,KEGG分析关键基因调控Cysteine缺乏诱导的CML细胞铁死亡的相关信号通路,q RT-PCR、Western blot验证关键基因表达变化。3构建干扰关键基因的慢病毒载体,嘌呤霉素筛选稳转株,q RT-PCR和Western blot鉴定下调效果,检测铁死亡相关指标,明确关键基因下调对Cysteine缺乏诱导的CML细胞铁死亡的影响;并用抑制剂加以验证。q RT-PCR、Western blot检测通路相关分子表达变化。4构建关键基因下调的CML细胞皮下瘤小鼠模型并鉴定,采用Cysteine缺乏饲料喂养,微量法检测瘤体Cysteine浓度变化;观察CML小鼠体重及皮下瘤体积、瘤体铁死亡超微结构变化;检测脂质ROS、MDA水平及铁死亡通路相关分子PTGS2、Tf R1、GSH和GPX4水平变化。结果:1 Cysteine缺乏后K562/G01细胞增殖能力明显下降且仅被铁死亡抑制剂Fer-1逆转(P1),其线粒体出现铁死亡特征性超微结构变化、ROS和MDA水平均明显升高(P1),而上述结果未见于K562细胞。两株CML细胞Cysteine缺乏后GSH含量和GPX4酶活性均下降(P1)。2 RNA-Seq筛查发现Cysteine缺乏后K562/G01细胞中与氧化还原密切相关的txnrd1基因显著上调,KEGG分析显示txnrd1可通过NRF2抗氧化信号通路影响细胞增殖。经q RT-PCR和Western blot验证,txnrd1基因表达在K562/G01中显著上调(P1)而在K562细胞中无明显变化,其酶活性在K562/G01细胞中降低(P1),但在K562细胞中却无变化。3成功构建txnrd1下调的慢病毒载体并感染K562细胞,嘌呤霉素筛选出稳转株,q RT-PCR和Western blot验证K562细胞中txnrd1明显下调且酶活性下降(P1)。Cysteine缺乏后,与NC组相比,txnrd1 sh RNA组的细胞活力显著降低(P1),可被Fer-1逆转(P1);TEM可观察到细胞线粒体嵴减少且外膜破裂,细胞质中存在大量脂滴;脂质ROS和MDA水平升高(P1)。txnrd1抑制剂处理同样可使K562细胞在Cysteine缺乏后出现铁死亡。4 txnrd1稳定下调的K562细胞在Cysteine缺乏后NRF2、HMOX1和NQO1的m RNA和蛋白水平均升高,且NRF2蛋白入核增加(Ptxnrd1下调的CML皮下瘤小鼠模型,经瑞氏和HE染色可观察到小鼠皮下瘤CML细胞典型形态学特征和人CD45阳性;Cysteine缺乏饲料喂养14天后,CML小鼠瘤体细胞中Cysteine浓度明显降低(P1);txnrd1下调的小鼠皮下瘤体积明显减小,且出现铁死亡特异性超微结构变化,ROS和MDA水平均升高(P1),PTGS2和Tf R1的m RNA和蛋白表达水平均升高(Ptxnrd1酶活性均明显降低(P1),通路相关分子NRF2、HMOX1和NQO1的m RNA和蛋白水平均升高,且NRF2蛋白入核增加(P1 Cysteine缺乏可诱导CML细胞铁死亡,且不同CML细胞敏感性不同;2 txnrd1是调控体内、外Cysteine缺乏诱导的CML细胞铁死亡发生的关键基因;3 txnrd1调控Cysteine缺乏诱导CML细胞铁死亡的发生与NRF2抗氧化信号通路密切相关。

关键词： txnrd1 Cysteine缺乏铁死亡 CML

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txnrd1相关铁死亡蛋白与鼻咽癌复发/转移的相关性研究

TXNRD1相关铁死亡蛋白与鼻咽癌复发/转移的相关性研究

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作者：郭洪洁湖北医药学院

学位级别：硕士

背景:鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种与EB病毒感染(EpsteinBarr virus,EBV)相关的癌症,是我国华南地区尤其是广东省的主要公共卫生问题,其首选治疗方式是放疗,并辅以化疗。目前影响鼻咽癌患者生存的原因主要是治疗后出现... 详细信息

背景:鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种与EB病毒感染(EpsteinBarr virus,EBV)相关的癌症,是我国华南地区尤其是广东省的主要公共卫生问题,其首选治疗方式是放疗,并辅以化疗。目前影响鼻咽癌患者生存的原因主要是治疗后出现复发及远处转移,且复发性鼻咽癌治疗后易出现多种致死性并发症,且具有一定的放疗抗性,治疗极其棘手。所以寻找能有效预测鼻咽癌复发的特异性标志物,将容易复发的鼻咽癌患者早期甄别出来,并提供个性化医疗以降低肿瘤复发,这对提高患者生活质量极为重要。铁死亡作为一种铁依赖性,以脂质过氧化物累积为特征的程序性细胞死亡,被认为是一种肿瘤生长抑制剂,目前被发现与头颈部鳞状细胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)的生长调节密切相关。以谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)为中心的脂质抗氧化系统是逆向调控铁死亡的重要通路,是目前研究的重点和热点,而txnrd1参与的硫氧还蛋白系统是细胞内的辅助抗氧化系统,在维持细胞氧化还原状态的平衡和调节也是必不可少的,但目前相关研究较少。目前已报道txnrd1在多种癌症中呈高表达,例如HNSCC、肝癌、乳腺癌、前列腺癌和甲状腺癌,并且与侵袭性肿瘤的不良预后相关。在肝癌组织和细胞中,txnrd1相对于正常组织上调,在Nrf2的转录激活的驱动下,txnrd1抵消肝癌中产生的细胞内活性氧并促进肝癌细胞的增殖,这些发现表明txnrd1对促进肿瘤发展有重要作用。基于以上研究背景,本课题围绕与txnrd1相关的铁死亡基因,通过细胞实验、生信分析、免疫组化(Immunohistochemistry,IHC),在鼻咽癌复发/转移的作用及预测价值上展开研究,为鼻咽癌复发/转移寻找新的标志物。目的:首先在细胞实验中验证HNSCC存在铁死亡,铁死亡诱导剂能抑制HNSCC细胞生长。其次利用数据库寻找HNSCC中与txnrd1相关的铁死亡基因,分析其在头颈部鳞癌组织和正常组织的表达情况以及与患者预后的相关性,最后利用鼻咽癌患者组织标本的免疫组化结果来验证生信筛选出的txnrd1相关的铁死亡蛋白与鼻咽癌复发/转移的相关性及预测价值。方法:(1)通过培养鼻咽癌细胞CNE-1及喉癌细胞HEP-2分析HNSCC中是否存在铁死亡,通过不同浓度的铁死亡诱导剂研究铁死亡对HNSCC生长的抑制情况。(2)利用UALCAN数据库查找与txnrd1相关性强的铁死亡基因,比较其在HNSCC与正常组织的表达情况及与临床分期的关系;通过THPA数据库分析候选蛋白与患者生存时间的相关性。(3)将鼻咽癌患者分为复发转移组和随访正常组,通过IHC检测两组病理标本候选预测蛋白的表达,比较两组患者的一般资料、候选预测蛋白在两组之间的表达情况以及其与临床病理参数的相关性。采用多因素二元Logistic回归分析影响鼻咽癌复发/转移的因素,绘制ROC曲线分析铁死亡相关蛋白对鼻咽癌复发/远处转移的预测价值。结果:(1)细胞实验结果:(1)鼻咽癌CNE-1、喉癌HEP-2细胞中存在铁死亡。(2)铁死亡诱导剂ML210能抑制CNE-1、HEP-2的增殖,且呈浓度依赖性。(2)公共数据库结果:(1)在HNSCC中与txnrd1强相关的铁死亡基因有SLC7A11、GCLM、GCLC,并且SLC7A11、GCLM、GCLC在HNSCC的表达水平高于正常组织。(2)生存分析结果显示:SLC7A11、GCLM、GCLC表达水平高的HNSCC患者生存时间缩短,且SLC7A11、GCLM蛋白表达水平与生存时间具有显著相关性。(3)免疫组化结果:(1)GCLM和GCLC在复发转移组中的阳性率均显著高于随访正常组。(2)GCLM蛋白表达与年龄、临床分期相关,GCLC蛋白表达与临床分期相关。(3)两组在年龄和临床分期构成比上差异具有统计学意义。(4)多因素二元Logistic回归分析结果显示:GCLM表达水平能影响鼻咽癌复发/转移。(5)ROC曲线分析结果提示GCLM作为预测鼻咽癌复发/远处转移的蛋白标志物具有一定价值。结论:(1)HNSCC细胞中存在铁死亡,铁死亡诱导剂能抑制HNSCC的生长。(2)铁死亡相关蛋白(x CT、GCLM、GCLC)是HNSCC患者的不利因素。(3)GCLM蛋白可能成为鼻咽癌患者复发/远处转移的新型分子标志物,对预测鼻咽癌复发/远处转移具有一定价值。

关键词： txnrd1 铁死亡鼻咽癌预测因子 GCLM

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溶质载体家族成员5（SLC27A5）调控肝癌细胞的增殖迁移及相关机制研究

溶质载体家族成员5（SLC27A5）调控肝癌细胞的增殖迁移及相关机制...

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作者：郑亚秋重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:肝细胞肝癌是发病率较高的一种恶性肿瘤,2015年全球新发肝癌病例数超过85万,死亡病例超过81万,其中我国肝癌死亡病例也居高不下,死亡率在癌症中排名第四位。肝癌起病隐匿,常较早发生转移,就诊时往往已是中晚期,加之治疗手段有限,... 详细信息

目的:肝细胞肝癌是发病率较高的一种恶性肿瘤,2015年全球新发肝癌病例数超过85万,死亡病例超过81万,其中我国肝癌死亡病例也居高不下,死亡率在癌症中排名第四位。肝癌起病隐匿,常较早发生转移,就诊时往往已是中晚期,加之治疗手段有限,目前肝癌的诊治仍是迫切需要解决的问题。因此积极探索肝癌的发病机制,寻找能预测临床肝癌患者预后的分子标记物,将为肝癌的诊断和治疗提供新思路和理论依据。脂肪代谢在维持细胞内环境稳态上发挥十分重要的作用,同时也是机体内非常重要的代谢途径。脂肪酸是能量代谢的重要底物,并且也是构成生物膜脂质和信号分子的重要组成成分。恶性肿瘤细胞的重要特征之一是细胞异常增殖,而肿瘤细胞的细胞膜形成和异常信号分子的传递过程需要更多的脂肪酸代谢参与。脂质代谢改变作为肿瘤的一个重要代谢特点,表现为脂肪酸从头合成和氧化代谢活跃,这揭示癌变细胞可能会通过加强从头合成来增加其所需的脂肪酸,从而为肿瘤细胞的高速增殖提供能量。SLC27(solute carrier family 27)编码的蛋白称为脂肪酸转运蛋白(fatty acid transport proteins,FATPs),它们属于介导长链和极长链脂肪酸跨膜转运的载体蛋白家族,在动物组织细胞脂肪酸和脂肪代谢中发挥重要作用。SLC27A5(solute carrier family 27 member 5)作为脂肪酸转运蛋白家族的成员,在肝脏特异高表达,提示其对于肝脏的脂肪酸代谢具有重要的调控作用。有文献报道,SLC27A5基因敲除小鼠肝细胞脂肪酸吸收率降低了50%,游离脂肪酸和甘油三酯含量相应降低,且未发现FATPs其他家族成员有代偿性表达升高,说明肝细胞SLC27A5对长链脂肪酸的摄取、维持肝脏脂质平衡均发挥了非常重要的作用。但是SLC27A5对肝癌发生发展的影响及相关的机制尚未有相关文献报道,课题组前期实验中,通过GEO数据库筛选到肝癌组织差异低表达基因SLC27A5,TCGA数据库分析也证实了其在肝癌组织中低表达。因此本实验主要研究SLC27A5对肝癌细胞增殖迁移能力的影响及其相关机制探讨。实验方法:1、通过GEO数据库筛选到肝癌组织差异低表达基因SLC27A5,运用生物信息学方法进一步分析TCGA数据库SLC27A5在肿瘤组织和癌旁组织的表达情况,分析SLC27A5表达与患者预后之间的关系。2、采用Western blot、qRT-PCR和免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)方法检测SLC27A5在40对临床肝癌和癌旁组织的表达。采用Western blot检测SLC27A5在正常肝脏细胞和不同肝癌细胞系中的表达。3、运用基因重组技术构建SLC27A5过表达质粒,利用AdEasy腺病毒载体系统构建Ad SLC27A5重组腺病毒表达载体。肝癌细胞感染AdSLC27A5重组腺病毒,采用MTS实验、Edu(5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷)实验和直接克隆形成实验,检测SLC27A5对肝癌细胞增殖能力的影响;采用transwell小室实验和划痕实验检测SLC27A5对肝癌细胞迁移能力的影响。4、运用转录组测序技术方法及查阅文献,选取与肿瘤增殖迁移相关的靶基因SLC39A6(solute carrier family 39 member 6),IGFBP1(insulin-like growth factor binding protein 1)和txnrd1(Thioredoxin reductase 1),采用qRT-PCR和Western blot,分别在mRNA和蛋白水平验证靶基因的表达改变。5、采用Western blot、qRT-PCR和IHC方法检测SLC27A5和其下游靶基因txnrd1在肝癌和癌旁组织的表达相关性。采用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)和Western blot方法检测Nrf2的核转位。6、裸鼠皮下成瘤实验检测SLC27A5对体内肿瘤形成能力的影响。运用Western blot、qRT-PCR和IHC方法在体内进一步验证SLC27A5和其下游靶基因txnrd1的相关性。结果:1、采用Western blot、q RT-PCR方法检测了40对肝癌和癌旁组织标本SLC27A5的表达情况,Western blot结果发现有27对标本SLC27A5表达呈下调趋势,占67.5%,qRT-PCR检测发现SLC27A5表达也明显降低,且差异具有统计学意义(P1)。采用IHC方法检测了18对肝癌和癌旁组织标本,发现SLC27A5在肝癌组织中表达下调,其在细胞内定位主要位于胞浆。说明SLC27A5在肝癌组织的表达明显低于癌旁组织。2、构建SLC27A5重组腺病毒质粒并包装成重组腺病毒,通过Western b

关键词：溶质载体家族成员5(SLC27A5) 肝细胞肝癌 txnrd1 细胞增殖细胞迁移

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SLC27A5缺失通过激活Keap1/Nrf2通路促进肝癌增殖的机制研究

SLC27A5缺失通过激活Keap1/Nrf2通路促进肝癌增殖的机制研究

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中国生物化学与分子生物学会第十二届全国会员代表大会暨2018年全国学术会议

作者：高庆祝张桂冀郑亚秋杨翼黄爱龙汪凯唐霓重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室

目的研究溶质载体家族27成员5(Solute Carrier Family 27 Member 5,SLC27A5)在肝癌发生发展中的作用及其分子机制。方法利用TCGA数据分析肝癌与癌旁组织中SLC27A5表达情况及其与预后的关系,并在临床肝癌标本中进行Western Blot和免疫组... 详细信息

目的研究溶质载体家族27成员5(Solute Carrier Family 27 Member 5,SLC27A5)在肝癌发生发展中的作用及其分子机制。方法利用TCGA数据分析肝癌与癌旁组织中SLC27A5表达情况及其与预后的关系,并在临床肝癌标本中进行Western Blot和免疫组化验证;利用重组腺病毒和CRISPR/Cas9系统,分别建立SLC27A5过表达和基因敲除两种细胞模型,通过MTS、EdU和克隆形成实验观察SLC27A5对肝癌细胞增殖的影响,通过裸鼠皮下成瘤和肝原位移植瘤模型观察SLC27A5对肿瘤增殖的影响;利用RNA-Seq技术分析SLC27A5调控的靶基因,q-PCR、Western Blot和IHC技术证实SLC27A5对靶基因的调控;利用抗氧化反应元件(Anti-oxidant response element, ARE)-荧光素酶活性报告系统、q-PCR和Western Blot检测Keap1/Nrf2信号通路的活化状态;利用CellROX?Orange探针,丙二醛(MDA)检测试剂盒和4-羟基壬烯酸(4-HNE)抗体分别检测细胞内活性氧(ROS)和脂质过氧化水平;利用超高效液相色谱-串联质谱/质谱法(UPLC-MS/MS)测定4-HNE对Keap1蛋白半胱氨酸残基的修饰;肝癌细胞、裸鼠皮下成瘤和肝原位移植瘤模型中,观察沉默txnrd1联合索拉菲尼处理对肝癌细胞和肿瘤增殖和凋亡能力的影响。结果 TCGA数据分析和临床肝癌组织检测发现SLC27A5在肝癌组织中显著低表达(p1),其表达与肝细胞癌患者预后呈正相关(p1)。过表达SLC27A5抑制PLC/PRF/5和SK-Hep1细胞增殖;敲除SLC27A5基因促进HepG2细胞增殖,裸鼠皮下成瘤模型中过表达SLC27A5抑制肝癌增殖;肝原位移植瘤模型中敲除SLC27A5促进肝癌增殖。过表达SLC27A5下调txnrd1表达,敲除SLC27A5上调txnrd1的表达,临床肝癌组织标本中SLC27A5 mRNA表达与txnrd1 mRNA表达成负相关(r=-0.35,p=0.02)。过表达SLC27A5抑制ARE荧光素酶活性、Nrf2核转位和下游靶基因表达;敲除SLC27A5增加ARE荧光素酶活性、促进Nrf2核转位和下游靶基因表达。过表达SLC27A5抑制ROS产生和脂质过氧化,敲除SLC27A5促进ROS产生和脂质过氧化。UPLC-MS/MS检测4-HNE修饰Keap1蛋白半胱氨酸残基位点是Cys513和Cys518。与单用索拉非尼相比,沉默txnrd1联合索拉菲尼明显抑制肝癌细胞和肿瘤增殖、促进肝癌细胞和肿瘤凋亡。结论 SLC27A5异常低表达,增加ROS和脂质过氧化水平,激活Keap1/Nrf2抗氧化信号通路,上调txnrd1表达,促进肝癌增殖。

关键词： SLC27A5 肝细胞癌 ROS Keap1/Nrf2信号通路 txnrd1 索拉非尼

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