靶向GluN1/N2A受体N末端结构域变构调节剂的发现与神经保护活性评价

作     者：朱泓宇 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：冯伟;董铭心

授予年度：2023年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：NMDA受体 变构调节 虚拟筛选 神经保护 脑卒中 兴奋性毒性 

摘      要：目的:NMDA受体是一种离子型谷氨酸受体,具有钙离子高通透特性,是兴奋性突触传递的关键媒介。NMDA受体的生理激活参与突触可塑性、记忆形成、大脑发育和神经元存活等重要神经生物学过程。然而,病理条件下NMDA受体过度激活会产生兴奋性毒性导致神经元死亡。亚基选择学说发现,含有Glu N2A的NMDA受体激活促进神经元存活并发挥神经保护作用,而含有Glu N2B的NMDA受体激活是导致兴奋性毒性和神经元凋亡的主要原因。Glu N2A的正向变构调节剂(PAM)通过激活神经元存活信号来保护神经元,比传统的NMDAR拮抗剂有更长的治疗窗口和更少的不良反应。本研究旨在采用经典的药物发现策略,结合体内外活性评价,发现靶向Glu N1/N2A受体N末端结构域(NTD)的新型变构调节剂,提供新的缺血性脑卒中临床前药理学工具,为神经保护提供新思路。方法:首先,本研究采用基于分子对接的虚拟筛选技术,发现通过作用于Glu N1/N2A受体N末端结构域具有变构调节作用的潜在化合物。参照模拟小分子与受体亲和力打分并通过人工挑选确定候选化合物。其次,在分子水平构建NMDA受体不同亚型组合瞬时转染HEK-293的细胞模型,采用钙离子内流荧光检测法验证候选化合物的变构活性与选择性。对化合物进行ADME预测后,在细胞水平构建谷氨酸诱导PC-12细胞及HT-22细胞的兴奋性毒性药理学模型,评价候选化合物的体外神经保护活性及毒性。选定目标化合物在小鼠t MCAO模型中进行体内神经保护活性验证,考察其对缺血性脑损伤神经功能缺损的治疗效果,以及对脑梗死体积的影响。最后,采用分子模拟和蛋白质免疫印迹初步探究化合物发挥神经保护的机制。结果:虚拟筛选后通过药物化学经验进行人工挑选最终得到23个候选化合物;细胞外筛选中,钙离子内流荧光检测结果显示化合物02、03、04、05、06、15、18、19、20和23对Glu N2A亚基具有变构激活作用,且具有良好的选择性,确定为潜在的NMDAR PAM。与激动剂组相比,化合物15、23对激动剂诱导的钙离子内流增强作用最为显著(12.5%和11.8%,P0.005);上述化合物ADME特性良好,化合物02、03、04、06、15和19对PC-12和HT-22细胞相容性较好。化合物18、20和23在PC-12细胞上表现出毒性作用,05、18、20在HT-22细胞上表现出毒性作用;体外神经保护活性评价中,谷氨酸诱导细胞兴奋性毒性实验结果表明,PC-12细胞模型在0.1μM,1μM和10μM化合物干预下,02、03、04、05、19、20和23都表现出显著细胞保护作用。两个浓度作用下表现出显著细胞保护作用的化合物有06和18。在HT-22细胞模型中,化合物15和23在三个浓度干预下都表现出显著细胞保护作用。两个浓度作用下表现出保护作用的化合物有02、04、18和19;化合物15的体内神经保护活性评价中,中剂量组(5 mg/kg)和高剂量(10 mg/kg)与模型组相比,对神经缺损症状有明显的改善作用,并显著减小了缺血后的脑梗死体积(30.68%和42.70%,P0.005);分子对接结果表明,化合物15通过与受体残基Leu219,Ile 227,和Ile 239等的疏水作用,以及与Ser224的氢键相互作用,稳定结合在口袋中。WB结果显示化合物15增强了Glu N2A介导的下游CREB(c AMP反应元件结合蛋白)的磷酸化。结论:本研究建立了“in silico→in vitro→in vivo的系统药物发现策略,为临床治疗缺血性脑卒中提供了新思路,也证实了计算辅助药物发现方法在该体系中具有可行性;经分子水平实体筛选,确定化合物02、03、04、05、06、15、18、19、20和23为潜在Glu N1/N2A的PAM;在PC-12和HT-22双细胞系建立兴奋性毒性的体外评价模型,验证了上述10个化合物的体外神经保护活性;进一步验证了化合物15的体内抗缺血性脑卒中作用,也是首次报道了化合物15(Aegeline)的神经保护作用。综上,本论文研究结果为进一步筛选出具有治疗缺血性脑卒中功效的先导化合物的研发提供了新的依据。