流体剪切力介导Piezo1离子通道对MLO-Y4骨细胞凋亡及RANKL/OPG影响的机制研究

作     者：刘众成 

作者单位：兰州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：夏亚一

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：流体剪切应力 骨质疏松 Piezo1 凋亡 RANKL OPG NOTCH3 

摘      要：目的:骨质疏松是一种全身骨骼的慢性退行性疾病。目前关于骨质疏松的发生、发展以及转归机制相对不明确。Piezo1通道蛋白是一种于2010年发现的机械敏感性阳离子通道蛋白,已被证实在维持骨稳态、平衡骨形成与骨重塑过程中发挥作用。骨细胞作为哺乳动物骨骼系统中含量最丰富的细胞之一,其凋亡相关表型与骨骼健康的关系不容忽视。RANKL/OPG作为调控破骨细胞分化及形成的关键分子,由骨细胞分泌并发挥重要作用。因此,对机械应力介导下Piezo1通道蛋白如何调控骨细胞凋亡以及RANKL/OPG分泌进行研究,可能对治疗骨质疏松提供新的治疗思路。方法:使用流体剪切应力(Fluid shear stress,FSS)加载装置对小鼠MLO-Y4骨样细胞进行干预,通过免疫荧光染色和Western blot探究FSS在MLO-Y4细胞中对Piezo1的调控作用及最佳条件。分别使用Piezo1激活剂Yoda1、阻滞剂Gs MTx4、FSS、siRNA-NOTCH3单独或双相对MLO-Y4细胞进行干预,应用Western blot及qRT-PCR检测NOTCH3、RANKL、OPG的表达情况;应用Western blot、Hoechnst-33258染色及流式细胞检测凋亡情况以及相关分子(Bcl-2、Cleaved Caspase-3以及Bax)的表达情况。结果:使用本课题组自行研发的FSS加载装置对MLO-Y4细胞进行干预后Piezo1蛋白表达呈现先上升后下降的单峰趋势,在9 dyne/cm下30分钟对Piezo1表达量的上调作用最佳(p0.05)。Piezo1激活剂Yoda1在10μmol/L浓度作用2小时可以下调NOTCH3(p0.0001)、RANKL(p0.01),上调OPG(p0.05)并抑制凋亡;阻滞剂Gs MTx4在4μmol/L浓度作用30分钟可以上调NOTCH3(p0.05)、RANKL(p0.05),下调OPG(p0.05)并促进凋亡。FSS可以通过上调Piezo1的表达量逆转或部分逆转Gs MTx4对NOTCH3(p0.05)、RANKL(p0.05)、OPG(p0.05)以及凋亡的作用。使用siRNA-NOTCH3对NOTCH3进行沉默后,Piezo1对RANKL/OPG的影响减弱。结论:1).FSS在9 dyne/cm强度下加载30分钟时上调MLO-Y4细胞的Piezo1表达。2).FSS介导Piezo1离子通道通过NOTCH3信号转导调控MLO-Y4细胞RANKL/OPG的表达。3).FSS通过Piezo1离子通道抑制MLO-Y4细胞凋亡。