O-GlcNAc修饰在DNA复制中的作用和机制研究

作     者：张港旋 

作者单位：东北师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：冯云鹏;魏民

授予年度：2022年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：O-GlcNAc修饰 DNA复制 OGT OGA 

摘      要：蛋白质翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs)是一种调控蛋白质功能的重要方式,参与多种生理功能和生物学事件的调节和维护。其中,O-Glc NAc修饰(O-Glc NAcylation)是一种发生在丝氨酸或苏氨酸上的单糖修饰。因其具有感受外界环境营养变化的特性,所以被称为营养的“感受器(nutrient sensor)。同时,O-Glc NAc修饰也是动态、可逆的。由糖基转移酶OGT(O-Glc NAc transferase)添加,由糖苷水解酶OGA(O-Glc NAcase)去除。截至目前,已有多种类型的蛋白,如转录因子、核孔蛋白、蛋白激酶、代谢酶、组蛋白等,被发现可以发生O-Glc NAc修饰。并且会在个体、细胞或分子等多个层次引起不同的生物学变化和生理功能的改变。近年的大量研究显示,O-Glc NAc修饰可以在基因组功能的调节和维护中发挥举足轻重的作用。无论是基因转录,还是DNA损伤修复,都有O-Glc NAc修饰的参与。同样是以DNA为模板的基础分子事件,DNA复制不仅是遗传物质传递的必要前提,而且还是细胞增殖和分裂的重要基础。但是,O-Glc NAc修饰是否可以在DNA复制过程发挥调节作用却仍不清楚。在本研究中,我们使用流式细胞术、免疫荧光、免疫沉淀以及免疫印迹等实验方法,结合基因沉默和外源过表达的技术策略,在肿瘤细胞MCF-7、U2OS、A549以及非肿瘤细胞NCM460、MCF-10A中,系统分析了O-Glc NAc修饰在DNA复制中的作用,并针对可能的分子机制进行了验证。首先,我们利用细胞周期同步化与抑制剂处理相结合的方式,分析了O-Glc NAc修饰与S期进程间的关系。流式分析结果显示,利用O-Glc NAc修饰的抑制剂DON(6-Diazo-5-oxo-L-norleucine)下调O-Glc NAc修饰会减缓S期进程,而使用OGA的抑制剂PUGNAc(O-(2-Acetamido-2-deoxy-d-glucopyranosyliden)amino-N-phenylcarbamate)上调O-Glc NAc修饰则可以产生促进作用。其次,通过影响O-Glc NAc修饰活化供体UDP-Glc NAc的合成或干涉糖基转移酶OGT下调O-Glc NAc修饰,可以抑制DNA的复制;反之,过表达OGT则可以促进DNA的复制。第三,通过抑制或干涉糖苷水解酶OGA上调O-Glc NAc修饰,会促进DNA的复制;反之,过表达OGA则可以下调O-Glc NAc修饰,抑制DNA的复制。第四,根据实验室未发表的实验证据:组蛋白H4第47位丝氨酸(H4S47)的O-Glc NAc修饰通过调节DNA解旋酶MCM2-7(minichromosome maintenance 2-7)复合物的功能,影响DNA的复制效率。我们通过免疫荧光实验,对H4S47的O-Glc NAc修饰在DNA复制中的作用进行了验证。结果显示,该位点的突变确实会下调DNA的复制效率,并且可以阻断PUGNAc对复制的促进作用。与野生型H4(H4)相比,突变体H4与解旋酶MCMs间的相互作用显著降低。综上所述,本研究揭示了O-Glc NAc修饰在基因组DNA复制和细胞周期S期进程中的调节功能,验证了组蛋白H4S47的O-Glc NAc修饰在这一过程中的重要作用。这些研究发现不仅丰富了O-Glc NAc修饰的新功能,而且还为深入理解蛋白质翻译后修饰在DNA复制以及细胞增殖中的关键作用提供了新的思路。