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o-glcnac修饰调控牛卵泡颗粒细胞和体外成熟卵母细胞葡萄糖代谢的机制研究

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O-GlcNAc修饰调控牛卵泡颗粒细胞和体外成熟卵母细胞葡萄糖代谢的...

作者：王腾飞中国农业科学院

学位级别：硕士

o-β-N-乙酰葡糖胺(o-linked beta-N-acetylglucosamine,o-Glc NAc)修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,在调节卵母细胞减数分裂成熟、早期胚胎发育等方面发挥重要作用。本文从作为感受微环境营养状态的o-Glc NAc修饰层面分别研究了o-Glc... 详细信息

o-β-N-乙酰葡糖胺(o-linked beta-N-acetylglucosamine,o-Glc NAc)修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,在调节卵母细胞减数分裂成熟、早期胚胎发育等方面发挥重要作用。本文从作为感受微环境营养状态的o-Glc NAc修饰层面分别研究了o-Glc NAc修饰水平变化对牛卵泡颗粒细胞增殖和卵母细胞体外成熟的影响,并进一步探究了o-Glc NAc修饰在葡萄糖摄取关键因子TXNIP调控牛体外成熟卵母细胞葡萄糖代谢中的作用。研究结果如下:试验一:研究了o-Glc NAc修饰水平变化对牛卵泡颗粒细胞增殖的影响。结果显示,采用BADGP处理颗粒细胞后,o-Glc NAc修饰、oGT和oGA蛋白表达均降低,而PUGNAc处理的颗粒细胞o-Glc NAc修饰和oGA蛋白表达升高,oGT蛋白表达降低;o-Glc NAc修饰水平的改变降低了颗粒细胞的活力和增殖相关基因CDC42、PCNA m RNA的表达,发生凋亡的颗粒细胞数增多,促凋亡基因BAX和Caspase-3 m RNA表达以及BAX/BCL-2的比值显著上调;同时,o-Glc NAc修饰水平改变降低了己糖激酶和丙酮酸激酶的活性、丙酮酸和乳酸含量、线粒体膜电位以及ATP水平;进一步研究发现,PUGNAc处理组颗粒细胞TXNIP表达显著下调。结果表明,o-Glc NAc修饰循环改变减少了牛颗粒细胞的葡萄糖摄取,诱导颗粒细胞损伤。试验二:研究了o-Glc NAc修饰水平变化对牛卵母细胞体外成熟的影响。结果显示,oGT和o-Glc NAc蛋白共定位于牛体外成熟卵母细胞的细胞质和细胞核中,而oGA和o-Glc NAc蛋白共定位于卵母细胞的细胞质中,且相对集中在皮质区;与对照组相比,BADGP处理组和PUGNAc处理组卵母细胞第一极体排出率(52.8%&60.9%vs.70.8%)和体外受精囊胚发育率(9.6%&10.0%vs.23.5%)均显著降低;进一步研究发现,BADGP处理组卵母细胞o-Glc NAc修饰和oGT蛋白表达下调,GFAT m RNA的表达上调,而在PUGNAc处理组,卵母细胞的o-Glc NAc修饰水平升高,oGT和oGA蛋白以及GFAT m RNA的表达均降低;此外,o-Glc NAc修饰水平改变显著上调了卵母细胞TXNIP的表达。结果表明,o-Glc NAc修饰水平改变降低牛卵母细胞体外成熟及发育能力,影响了oGT、oGA、GFPT以及TXNIP的表达。试验三:研究了o-Glc NAc修饰对TXNIP调控牛卵母细胞体外成熟的影响。结果显示,TXNIP抑制剂Aza处理组卵母细胞第一极体排出率和葡萄糖摄取能力升高,糖酵解和磷酸戊糖代谢活性增强,表现为胞内谷胱甘肽水平、磷酸果糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性升高,乳酸生成、ATP和NADPH水平增多,卵母细胞谷氨酰胺:6-磷酸果糖氨基转移酶活性减弱,o-Glc NAc修饰水平、oGT和TXNIP蛋白表达均下调;而糖基化底物Glc N抑制了Aza对牛卵母细胞体外成熟的促进作用以及对葡萄糖代谢的影响,包括减少卵母细胞的葡萄糖摄取、抑制磷酸果糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、降低乳酸、谷胱甘肽及NADPH的生成等;此外,Glc N能够上调Aza诱导的卵母细胞o-Glc NAc修饰水平下降,并且这一过程依赖于oGT的作用。

关键词：牛颗粒细胞卵母细胞 o-glcnac修饰 TXNIP

o-glcnac修饰在DNA复制中的作用和机制研究

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O-GlcNAc修饰在DNA复制中的作用和机制研究

作者：张港旋东北师范大学

学位级别：硕士

蛋白质翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs)是一种调控蛋白质功能的重要方式,参与多种生理功能和生物学事件的调节和维护。其中,o-Glc NAc修饰(o-Glc NAcylation)是一种发生在丝氨酸或苏氨酸上的单糖修饰。因其具有感受... 详细信息

蛋白质翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs)是一种调控蛋白质功能的重要方式,参与多种生理功能和生物学事件的调节和维护。其中,o-Glc NAc修饰(o-Glc NAcylation)是一种发生在丝氨酸或苏氨酸上的单糖修饰。因其具有感受外界环境营养变化的特性,所以被称为营养的“感受器”(nutrient sensor)。同时,o-Glc NAc修饰也是动态、可逆的。由糖基转移酶oGT(o-Glc NAc transferase)添加,由糖苷水解酶oGA(o-Glc NAcase)去除。截至目前,已有多种类型的蛋白,如转录因子、核孔蛋白、蛋白激酶、代谢酶、组蛋白等,被发现可以发生o-Glc NAc修饰。并且会在个体、细胞或分子等多个层次引起不同的生物学变化和生理功能的改变。近年的大量研究显示,o-Glc NAc修饰可以在基因组功能的调节和维护中发挥举足轻重的作用。无论是基因转录,还是DNA损伤修复,都有o-Glc NAc修饰的参与。同样是以DNA为模板的基础分子事件,DNA复制不仅是遗传物质传递的必要前提,而且还是细胞增殖和分裂的重要基础。但是,o-Glc NAc修饰是否可以在DNA复制过程发挥调节作用却仍不清楚。在本研究中,我们使用流式细胞术、免疫荧光、免疫沉淀以及免疫印迹等实验方法,结合基因沉默和外源过表达的技术策略,在肿瘤细胞MCF-7、U2oS、A549以及非肿瘤细胞NCM460、MCF-10A中,系统分析了o-Glc NAc修饰在DNA复制中的作用,并针对可能的分子机制进行了验证。首先,我们利用细胞周期同步化与抑制剂处理相结合的方式,分析了o-Glc NAc修饰与S期进程间的关系。流式分析结果显示,利用o-Glc NAc修饰的抑制剂DoN(6-Diazo-5-oxo-L-norleucine)下调o-Glc NAc修饰会减缓S期进程,而使用oGA的抑制剂PUGNAc(o-(2-Acetamido-2-deoxy-d-glucopyranosyliden)amino-N-phenylcarbamate)上调o-Glc NAc修饰则可以产生促进作用。其次,通过影响o-Glc NAc修饰活化供体UDP-Glc NAc的合成或干涉糖基转移酶oGT下调o-Glc NAc修饰,可以抑制DNA的复制;反之,过表达oGT则可以促进DNA的复制。第三,通过抑制或干涉糖苷水解酶oGA上调o-Glc NAc修饰,会促进DNA的复制;反之,过表达oGA则可以下调o-Glc NAc修饰,抑制DNA的复制。第四,根据实验室未发表的实验证据:组蛋白H4第47位丝氨酸(H4S47)的o-Glc NAc修饰通过调节DNA解旋酶MCM2-7(minichromosome maintenance 2-7)复合物的功能,影响DNA的复制效率。我们通过免疫荧光实验,对H4S47的o-Glc NAc修饰在DNA复制中的作用进行了验证。结果显示,该位点的突变确实会下调DNA的复制效率,并且可以阻断PUGNAc对复制的促进作用。与野生型H4(H4)相比,突变体H4与解旋酶MCMs间的相互作用显著降低。综上所述,本研究揭示了o-Glc NAc修饰在基因组DNA复制和细胞周期S期进程中的调节功能,验证了组蛋白H4S47的o-Glc NAc修饰在这一过程中的重要作用。这些研究发现不仅丰富了o-Glc NAc修饰的新功能,而且还为深入理解蛋白质翻译后修饰在DNA复制以及细胞增殖中的关键作用提供了新的思路。

关键词： o-glcnac修饰 DNA复制 oGT oGA

基于ERα的o-glcnac修饰探讨柴胡加龙骨牡蛎汤改善绝经过渡期小鼠的睡眠作用

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基于ERα的O-GlcNAc修饰探讨柴胡加龙骨牡蛎汤改善绝经过渡期小鼠...

作者：张丽欣黑龙江中医药大学

学位级别：硕士

目的绝经过渡期是女性必经的生命阶段,伴随着激素水平的异常波动,脑内雌激素受体(Estrogen receptor,ER)网络也会随之发生变化,表现为ER的水平及敏感性下降,从而导致一系列神经精神系统症状的出现,尤其是失眠,在女性的绝经过渡期发病率... 详细信息

目的绝经过渡期是女性必经的生命阶段,伴随着激素水平的异常波动,脑内雌激素受体(Estrogen receptor,ER)网络也会随之发生变化,表现为ER的水平及敏感性下降,从而导致一系列神经精神系统症状的出现,尤其是失眠,在女性的绝经过渡期发病率明显高于其他生命阶段。临床研究显示,绝经过渡期女性的睡眠调查研究多以主观量表测试为主,且测试结果与有限的多导睡眠监测得到的客观睡眠时间并不一致。4-乙烯基环己烯二环氧化合物(4-Vinylcyclohexene Diepoxide,VCD)是一种卵巢毒性化学物质,可以模拟女性从生育期、到绝经过渡期、到绝经期的动态过程,在绝经过渡期相关疾病的研究中应用广泛,但对于睡眠-觉醒时相的研究,尚未见报道。o-连接β-N-乙酰葡糖胺(o-linkedβ-N-acetylglucosamine,o-glcnac)是细胞内蛋白质的单糖翻译后修饰,其可修饰ER,并调节ER的水平和活性。柴胡加龙骨牡蛎汤作为中医临床常用的改善女性绝经过渡期失眠的经典方剂,其作用机制尚不清楚。基于上述认识,本研究首先以VCD所致的绝经过渡期小鼠为动物模型,阐明绝经过渡期睡眠-觉醒时相的变化特点。然后在确定柴胡加龙骨牡蛎汤具有改善绝经过渡期小鼠睡眠作用的基础上,基于ERα的o-glcnac修饰探讨柴胡加龙骨牡蛎汤改善绝经过渡期小鼠睡眠作用的机制。方法第一部分绝经过渡期小鼠睡眠-觉醒时相的变化八周龄ICR小鼠随机分为8组,即VCD 20 d,VCD 35 d,VCD 52 d,VCD 63 d,及相应的对照组,Control 20 d,Control 35 d,Control 52 d,Control 63 d。VCD 和 Control 组小鼠每日早 8:00 分别腹腔注射VCD(160 mg/kg,0.05 mL/10 g),和相同体积的芝麻油,每日注射一次,每周连续注射5 d,连续注射4 w,共注射20 d。各组小鼠分别于注射VCD或芝麻油的第20 d、第35 d、第52 d、第63 d进行皮层脑电和肌电监测,分析其全天、日间和夜间的觉醒(WAKE)、非快速眼球运动(Non-rapid eye movements sleep,NREM)睡眠和快速眼球运动(Rapid eye movements sleep,REM)睡眠的时间,发生次数及发生的平均持续时间。第二部分绝经过渡期小鼠下丘脑ERα、oGT、oGA、o-glcnac蛋白的表达实验分组及给药方法同第一部分。各组小鼠分别于注射VCD或芝麻油的第20 d、第35 d、第52 d、第63 d,采用Western blot技术,测定各组小鼠下丘脑ERα、oGT、oGA、总o-glcnac蛋白的表达。第三部分CJLM70E对绝经过渡期小鼠睡眠-觉醒时相的影响八周龄ICR小鼠随机分为4组,即Control组,VCD组,CJLM70E组和E组。Control组腹腔注射芝麻油,其余各组均腹腔注射VCD。于注射VCD或芝麻油的第35 d,CJLM70E组灌胃给予CJLM70E(48 mg/kg,0.2 mL/10 g),E组灌胃给予雌二醇(0.13 mg/kg,0.2 mL/10 g),VCD组和Control组灌胃给予同体积1%CMC-Na,连续4w。各组动物在给药第1 w、第2 w、第3 w、第4 w时进行皮层脑电和肌电监测,分析其24 h Wake、NREM睡眠和REM睡眠的时间,发生次数及发生的平均持续时间。第四部分CJLM70E改善绝经过渡期小鼠睡眠作用的机制实验分组及给药同第三部分。各组小鼠于给药1 w时,采用Western blot技术测定各组小鼠下丘脑 ERα、oGT、oGA、总o-glcnac蛋白的表达;免疫共沉淀技术验证ERα的o-glcnac修饰;免疫荧光技术测定下丘脑VLPo和PVN脑区ERα和o-glcnac蛋白的表达。结果第一部分绝经过渡期小鼠睡眠-觉醒时相的变化与相应的 Control 组相比,VCD 20 d、VCD 35 d 和 VCD 52 d小鼠的Wake时间延长(P<0.05),NREM和REM睡眠时间缩短(P<0.05),REM睡眠发生次数降低(P<0.05);VCD 63 d小鼠的Wake和NREM睡眠发生次数升高(P<0.05),NREM睡眠发生的平均持续时间降低(P<0.05),与VCD 20 d、VCD 35 d、VCD 63 d相比,VCD 52 d小鼠的Wake时间延长,REM睡眠时间和发生次数降低(P<0.05);与 VCD 20 d、VCD 35 d、VCD 52 d 相比,VCD 63 d小鼠的Wake和NREM睡眠发生次数增加(P<0.05),发生的平均持续时间和Wake时间缩短(P<0.05)。第二部分绝经过渡期小鼠下

关键词：绝经过渡期睡眠-觉醒周期柴胡加龙骨牡蛎汤 ERα o-glcnac修饰

oGA通过影响NSL3的o-glcnac修饰调控线粒体MT-ATP6转录

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OGA通过影响NSL3的O-GlcNAc修饰调控线粒体MT-ATP6转录

作者：孙琳吉林大学

学位级别：硕士

细胞适应环境变化的程度是细胞持续功能和存活的决定因素。细胞的这种适应依赖于转录程序的精确协调,营养,代谢,环境因素,都会造成关键中间代谢物的波动。细胞会通过这些代谢物的变化来感知环境的变化并进行响应。细胞实现对环境响应的... 详细信息

细胞适应环境变化的程度是细胞持续功能和存活的决定因素。细胞的这种适应依赖于转录程序的精确协调,营养,代谢,环境因素,都会造成关键中间代谢物的波动。细胞会通过这些代谢物的变化来感知环境的变化并进行响应。细胞实现对环境响应的方式是利用这些代谢产物对靶蛋白进行一系列修饰,这些利用代谢产物对靶蛋白进行的一系列修饰最终作用在基因的转录调控层面。在整个环境响应过程中o-glcnac起到核心作用,因为葡萄糖在代谢响应中扮演重要的角色,在多种形式的响应中,细胞对于葡萄糖的摄取量发生变化。葡萄糖进入细胞以后,大约2%～5%进入HBP,合成oGT作用底物UDP-glcnac。蛋白质的o-glcnac修饰是葡萄糖发挥作用的最终体现形式。o-glcnac修饰是一种常见的翻译后修饰(PTM),发生在蛋白质丝氨酸或苏氨酸残基上,可以快速响应细胞内的不同刺激,维持一种动态的、可逆的修饰,实现对信号的整合与传递。细胞内只有两种酶负责o-glcnac修饰,分别是负责添加UDP-glcnac的oGT和负责去除o-glcnac修饰的oGA。本研究构建了plvx-puro-sh oGA质粒,并从蛋白和m RNA水平上验证敲低效果,确定oGA敲低可行性后通过MTT、细胞划痕实验、免疫荧光染色、线粒体提取、RT-q PCR、western blot等一系列实验,验证oGA表达量改变后对宫颈癌细胞的增殖、迁移能力的影响,以及这个过程中涉及到的o-glcnac修饰对线粒体mtDNA的转录调控。本研究分为以下五个部分:1.成功构建plvx-puro-sh oGA质粒,并通过RT-q PCR、western blot实验从m RNA和蛋白质水平上均验证了oGA的敲低效果,并且确立了瞬转72小时敲低效果最佳。2.利用MTT实验证明在293T和He La细胞中oGA表达量增加后促进细胞的增殖能力。细胞划痕实验证明在He La细胞中oGA表达量增加后促进细胞的迁移能力。3.实验室前期数据证明o-glcnac修饰可以稳定NSL3,推测oGA通过改变NSL3稳定性进而转录调控mtDNA。通过RT-q PCR实验证明在293T和He La细胞中oGA的表达量增加或者NSL3的表达量减少会抑制线粒体编码的mtDNA的转录。通过回复实验证明NSL3可以缓解oGA改变造成mtDNA的变化。***-tracker染色、免疫荧光染色以及线粒体提取等实验证明oGA、NSL3、MoF均在线粒体中有分布,提示NSL3、MoF具有对mtDNA的转录调控作用。5.过表达oGA后,o-glcnac修饰减少,线粒体中的NSL3和MoF的含量显著减少;加入oGA抑制剂TMG后,o-glcnac修饰增加,线粒体中的NSL3的含量显著增加。本实验得到结论,1.明确o-glcnac修饰对线粒体基因转录调控可能是由于NSL3稳态变化造成的。***复合物可能作为o-glcnac状态的传感器,通过o-glcnac修饰感应外部营养环境,进而引起响应并调控线粒体氧化磷酸化基因的转录。

关键词： oGA o-glcnac修饰 NSL3 MoF 线粒体 mtDNA 宫颈癌

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o-glcnac修饰研究进展

军事医学科学院院刊 2006年第1期30卷 68-72页

作者：蒯学章张令强贺福初北京放射与辐射医学研究所北京100850

N-乙酰葡萄糖胺(o-G lcNAc)修饰是一种新鉴定的蛋白质糖基化方式,在细胞内分布广泛,通过糖基转移酶和糖苷酶将N-乙酰葡萄糖胺单糖添加或移除到蛋白质的丝/苏氨酸残基上,并可能与磷酸化存在直接或间接的相互影响,参与转录调控、信号转导... 详细信息

N-乙酰葡萄糖胺(o-G lcNAc)修饰是一种新鉴定的蛋白质糖基化方式,在细胞内分布广泛,通过糖基转移酶和糖苷酶将N-乙酰葡萄糖胺单糖添加或移除到蛋白质的丝/苏氨酸残基上,并可能与磷酸化存在直接或间接的相互影响,参与转录调控、信号转导、蛋白酶解等多种重要保守的生命活动,从而发挥营养传感器和压力感受器的作用,调节细胞对外界刺激的反应。同时有研究表明,2型糖尿病和老年神经退行性疾病与o-G lcNAc修饰水平的升高和降低也有密切关系。

关键词： o-glcnac修饰磷酸化糖基化营养传感器压力感受器糖尿病,非胰岛素依赖型神经变性疾病

o-glcnac修饰在谷氨酰胺减轻脓毒症大鼠脑损伤中的作用

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中华麻醉学杂志 2012年第5期32卷 613-615页

作者：王瑾陆新健郑康景亮 210009南京市东南大学附属中大医院麻醉科

目的评价o-glcnac修饰在谷氨酰胺减轻脓毒症大鼠脑损伤中的作用。方法健康清洁级4周龄sD雄性大鼠60只，体重180～240g，采用随机数字表法，将其随机分为4组：假手术组（s组，n=12）、脓毒症组（CLP组，n=16）、谷氨酰胺组（G组，n=16）... 详细信息

目的评价o-glcnac修饰在谷氨酰胺减轻脓毒症大鼠脑损伤中的作用。方法健康清洁级4周龄sD雄性大鼠60只，体重180～240g，采用随机数字表法，将其随机分为4组：假手术组（s组，n=12）、脓毒症组（CLP组，n=16）、谷氨酰胺组（G组，n=16）及谷氨酰胺＋四氧嘧啶组（G＋A组，n=16）。采用盲肠结扎穿孔术（CLP）建立大鼠脓毒症模型，G组术毕静脉注射谷氨酰胺0．75g／kg，G＋A组术毕静脉注射谷氨酰胺0．75g／kg及腹腔注射四氧嘧啶90mg／kg，CLP组和s组注射等容量生理盐水。术后24h时记录神经反射评分，断颈处死，测定脑组织含水量，采用Western—blot法测定脑组织o-glcnac表达水平，观察脑组织病理学结果。结果与s组比较，CLP组、G组及G＋A组大鼠脑组织含水量、神经反射评分升高（P〈0．05）；与CLP组比较，G组和G＋A组大鼠脑组织含水量、神经反射评分降低，G组大鼠脑组织蛋白质o-glcnac表达上调（P〈0．05）；与G组比较，G＋A组大鼠脑组织含水量、神经反射评分升高，脑组织蛋白质o-glcnac表达下调（P〈0．05）；S组、CLP组及G＋A组大鼠间脑组织蛋白质o-glcnac表达差异无统计学意义（P〉0．05）。G组病理学损伤较CLP组及G＋A组轻。结论o-glcnac修饰参与了谷氨酰胺减轻脓毒症大鼠脑损伤的过程。

关键词：谷氨酰胺脓毒症 o-glcnac修饰脑

o-glcnac修饰蛋白质的生理功能和研究方法

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生命的化学 2007年第1期27卷 14-17页

作者：宋丽娜王京兰钱小红蔡耘军事医学科学院放射医学研究所基因组与蛋白质组实验室北京100850 北京蛋白质组中心北京102206

氧连N-乙酰葡糖胺(o-glcnac)修饰是与磷酸化相类似的蛋白质翻译后修饰方式,它主要发生在细胞核和细胞质中的蛋白质上,与细胞信号通路密切相关,成为近年来的研究热点。该文主要从o-glcnac修饰蛋白质的生理功能和研究方法两方面介绍该领... 详细信息

氧连N-乙酰葡糖胺(o-glcnac)修饰是与磷酸化相类似的蛋白质翻译后修饰方式,它主要发生在细胞核和细胞质中的蛋白质上,与细胞信号通路密切相关,成为近年来的研究热点。该文主要从o-glcnac修饰蛋白质的生理功能和研究方法两方面介绍该领域近年来的研究成果。

关键词：蛋白质翻译后修饰(PTM) 蛋白质组学 o-glcnac修饰富集鉴定方法

o-glcnac修饰通过促进子宫内膜细胞增殖、迁移和侵袭影响子宫内膜容受性的研究

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O-GlcNAc修饰通过促进子宫内膜细胞增殖、迁移和侵袭影响子宫内膜...

作者：韩笑大连医科大学

学位级别：硕士

一、目的o-Glc NAc糖基化是一种动态的翻译后修饰,是指在胞浆蛋白和核蛋白的Ser或Thr上以o-糖苷键连接单个N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine,Glc NAc)。这种动态修饰由o-Glc NAc糖基转移酶(oGT)催化,由o-Glc NAc糖苷酶(oGA)去除。子宫... 详细信息

一、目的o-Glc NAc糖基化是一种动态的翻译后修饰,是指在胞浆蛋白和核蛋白的Ser或Thr上以o-糖苷键连接单个N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine,Glc NAc)。这种动态修饰由o-Glc NAc糖基转移酶(oGT)催化,由o-Glc NAc糖苷酶(oGA)去除。子宫内膜接受性是指子宫内膜在一定时间内有利于囊胚生长、附着及随后植入事件的发生,这种状态的持续时间称为着床窗口期。目前对o-Glc NAc修饰功能的研究多集中在肿瘤的发生及转移上,肿瘤的侵袭和转移机制和胚胎与子宫内膜的识别、黏附类似。蛋白质糖基化修饰在胚胎着床及发育中起重要作用,但o-Glc NAc修饰在着床调控领域的作用研究尚属空白。本文检测了小鼠和人不同时期子宫内膜o-Glc NAc修饰蛋白表达差异,分别以子宫内膜癌细胞RL95-2/HEC-1A模拟高、低接受态子宫内膜,分析o-Glc NAc修饰在高低接受态子宫内膜细胞中的表达。以RNAi技术调控oGT和oGA的表达,分析o-Glc NAc修饰对子宫内膜细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响并检测对调控子宫内膜细胞EMT过程相关蛋白的调控作用。以绒毛膜肿瘤细胞系(JAR)模拟侵入性胚胎,检测调控子宫内膜细胞中oGT的表达对JAR细胞与子宫内膜细胞黏附的影响。我们揭示了o-Glc NAc修饰调控胚胎着床及子宫内膜容受性建立可能的相关性及分子机制,从而为拓宽临床生殖中蛋白质糖基化修饰作用提供理论依据。二、方法1、免疫组化检测:o-Glc NAc修饰蛋白在围着床期(D1-D5)妊娠小鼠子宫内膜的表达及分布规律。2、免疫组化及Western blot检测o-Glc NAc修饰蛋白在人月经周期各阶段子宫内膜中表达及分布情况。3、Real-time PCR检测o-Glc NAc糖基转移酶(oGT)在人月经周期不同阶段子宫内膜中的表达变化情况。4、Real-time PCR检测oGT、o-Glc NAc糖苷酶(oGA)在不同接受态子宫内膜细胞RL95-2(人高接受态子宫内膜细胞系)和HEC-1A(人低接受态子宫内膜细胞系)中表达情况。5、将小干扰RNA(si-NC、si-oGT)利用脂质体转染法转染到高表达oGT的RL95-2中,建立oGT沉默、o-Glc NAc糖基化修饰水平降低的细胞株。将si-NC、si-oGA转染到高表达oGA的HEC-1A细胞中,建立oGA沉默、o-Glc NAc糖基化修饰水平升高的细胞株。通过Real-time PCR和Western blot进行干扰效率的验证。6、JAR细胞模拟胚胎,体外黏附实验检测调控o-Glc NAc修饰对胚胎细胞与子宫内膜细胞之间黏附的影响。7、CCK-8、细胞划痕、Transwell小室检测调控o-Glc NAc修饰对子宫内膜细胞增殖、迁移和侵袭的影响。8、Western blot检测调控o-Glc NAc修饰水平的变化对EMT相关蛋白表达的影响。三、结果1、在妊娠围着床期小鼠子宫内膜中,D1-D4的o-Glc NAc修饰水平逐渐上升,D4达到顶峰,D5后降低。在小鼠子宫内膜组织中,o-Glc NAc糖基化修饰蛋白在各个部位都表达,但主要在基质细胞中表达。2、在临床增殖期子宫内膜,o-Glc NAc糖基化修饰蛋白几乎无表达。在分泌期子宫内膜,表达量明显上升。o-Glc NAc糖基化修饰蛋白主要定位人子宫内膜组织腺上皮和腔上皮细胞。3、分泌期子宫内膜oGT m RNA水平明显高于增殖期子宫内膜。4、在RL95-2细胞中,o-Glc NAc糖基转移酶(oGT)基因的表达明显高于HEC-1A细胞,o-Glc NAc糖苷酶(oGA)基因的表达明显低于HEC-1A细胞。5、RL95-2细胞中加入si-oGT后,下调oGT的表达使o-Glc NAc糖基化修饰水平降低。HEC-1A细胞中加入si-oGA后,下调oGA的表达,o-Glc NAc糖基化修饰水平升高,干扰模型构建成功。6、上调子宫内膜细胞中o-Glc NAc修饰水平会增强子宫内膜细胞的增殖、迁移和侵袭能力。7、上调子宫内膜细胞o-Glc NAc修饰水平能增加EMT相关蛋白的表达,促进EMT过程的发生,进而影响细胞的迁移和侵袭能力。8、JAR细胞与RL95-2细胞的黏附能力强于HEC-1A细胞。上调o-Glc NAc修饰可促进子宫内膜细胞与JAR细胞的黏附能力。四、结论1、o-Glc NAc修饰蛋白在着床窗口期表达增高,促进子宫内膜容受性的建立。2、o-Glc NAc修饰能够促进子宫内膜细胞增殖、迁移及侵袭能力,并促进胚胎细胞与子宫内膜细胞的黏附进而有利于子宫内膜容受性的建立和胚胎着床。3、o-Glc NAc修饰可能通过改变EMT相关蛋白的表达来影响细胞的迁移和侵袭能力。

关键词： o-glcnac修饰 oGT oGA 子宫内膜容受性

o-glcnac修饰对泛素化相关基因的调控

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O-GlcNAc修饰对泛素化相关基因的调控

作者：周丰天津大学

学位级别：硕士

多种翻译后修饰之间存在着复杂的联系，这种联系对于细胞活动特别是蛋白的降解和功能的调节起着重要作用。泛素化和o-glcnac修饰作为两种重要的翻译后修饰，二者之间存在联系。其中泛素化是泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连... 详细信息

多种翻译后修饰之间存在着复杂的联系，这种联系对于细胞活动特别是蛋白的降解和功能的调节起着重要作用。泛素化和o-glcnac修饰作为两种重要的翻译后修饰，二者之间存在联系。其中泛素化是泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）催化的多步反应，这些酶中有一些能被o-glcnac修饰，或在转录水平受o-glcnac修饰的蛋白调节。本研究发现了在HEK293T细胞中的蛋白泛素化和o-glcnac修饰的联系。通过在HEK293T细胞中转染oGT，使其过表达soGT、ncoGT，以及加入PUGNAc（oGA的抑制剂）和加入GLcN三种方式来提高细胞中蛋白的o-glcnac的修饰水平。在三种提高o-glcnac修饰水平的条件下，通过RT2profiler PCR array方法，检测人泛素化途径相关的84个基因转录水平的变化。其中FBXW10蛋白是一种泛素化的靶特定蛋白F-Box蛋白，在以上增加o-glcnac修饰的方式中都出现下调表达。根据GlcN对FBXW10基因有负调节作用，在HEK293T细胞中加入GlcN，在不同时间点进行real-timePCR和Western Blot检测，本研究发现在不同时间点mRNA水平和蛋白水平都有明显下调。另外本研究还发现HEK293T细胞中内源的FBXW10被o-glcnac修饰，o-glcnac修饰可能在多重水平上调节FBXW10。这些发现都说明o-glcnac修饰与泛素化相关基因的调节有关，对理解o-glcnac和泛素化之间的相互联系起到重要作用。

关键词：蛋白间相互应答泛素化 o-glcnac修饰 F-box蛋白 FBXW10 FBXo4 Real-timePCR 阵列分析