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胰岛β细胞oga敲除对小鼠β细胞功能和糖代谢的影响及分子机制的探究

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胰岛β细胞OGA敲除对小鼠β细胞功能和糖代谢的影响及分子机制的...

作者：袁强强西北大学

学位级别：硕士

【背景和目的】2型糖尿病是一种代谢疾病,由胰岛素抵抗和β细胞功能障碍共同作用引起。探讨β细胞损伤在糖尿病进展中的作用对于阐明糖尿病的发病机制至关重要。据报道,蛋白的O-GlcNAc修饰(O-GlcNAcylation)与β细胞损伤以及2型糖尿病... 详细信息

【背景和目的】2型糖尿病是一种代谢疾病,由胰岛素抵抗和β细胞功能障碍共同作用引起。探讨β细胞损伤在糖尿病进展中的作用对于阐明糖尿病的发病机制至关重要。据报道,蛋白的O-GlcNAc修饰(O-GlcNAcylation)与β细胞损伤以及2型糖尿病的发生发展密切相关。O-GlcNAc修饰是一种蛋白质翻译后修饰方式,由O-GlcNAc转移酶(O-GlcNAc transferase,OGT)和O-GlcNAc水解酶(O-GlcNAcase,oga)动态调控,其中OGT负责将UDP-GlcNAc引入到蛋白质的Ser和Thr位点上,而oga负责将蛋白上的O-GlcNAc糖链水解下来。蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰可通过感受己糖胺生物合成途径(HBP)通量来发挥营养感受器的功能,葡萄糖代谢可促进O-GlcNAc修饰底物UDP-GlcNAc的含量,促进蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰的发生。既往研究表明,OGT的缺失会导致β细胞衰竭和糖尿病的发生,然而过表达OGT未能改善β细胞功能紊乱及糖代谢损伤。尽管关于OGT对β细胞的作用有广泛的研究,但目前对于oga在胰岛β细胞中发挥的作用尚不完全清楚。因此,本研究通过构建普通饮食和高糖饮水(HGD)β细胞oga敲除小鼠模型以及oga敲减细胞系,来探究oga缺失对小鼠β细胞功能和糖代谢的作用及机制。【研究方法】1.胰岛β细胞oga敲除小鼠的构建与验证课题组前期使用基因打靶技术和Cre-Lox P系统成功构建了Ins2-Cre小鼠。接着通过鼠尾基因型鉴定和免疫组织化学染色(IHC)的方法对oga-βKO小鼠进行筛选和验证。2.小鼠糖代谢表型检测通过血糖及体重监控、腹腔注射葡萄糖耐量实验、悬液芯片多重因子检测以及胰腺组织Tunel染色的方法,探究无诱导条件下β细胞oga敲减对小鼠糖代谢的影响。接着我们对小鼠使用高糖饮水(HGD)造模,并通过血糖及体重监控、腹腔注射葡萄糖耐量、腹腔注射胰岛素耐量、小鼠脂肪称量以及体脂率检测的方法,进一步探究在代谢压力下β细胞oga敲除对小鼠糖代谢的影响。***-βKO小鼠能量代谢的检测本研究使用了美国Columbus仪器公司生产的综合实验室动物监测系统(CLAMS),实时监测小鼠在不同时间段(Light、Dark)以及不同处理(Fed、Fasted)条件下的氧气消耗量(VO)、二氧化碳释放量(VCO)、呼吸商(RER)以及产热(Heat),来评估胰岛β细胞oga缺失对小鼠能量代谢的影响。***敲除β细胞系的构建及功能验证使用si RNA技术构建oga敲减β细胞系,并通过Q-PCR技术对oga敲减β细胞系胰岛素及胰岛素转录因子(PDX-1、Maf A、Neuro D1)的m RNA水平进行检测,验证oga缺失对β细胞功能的影响。***1蛋白的表达检测根据文献报道,推测oga缺失导致的β细胞损伤可能与DRP1介导的线粒体动力学紊乱相关,因此我们利用Western Blot探究oga的缺失对β细胞DRP1蛋白表达的影响,并初步探讨oga通过调控DRP1介导的线粒体动力学紊乱对胰岛β细胞功能的影响。【研究结果】1.成功构建并筛选出oga-βKO小鼠;oga-βKO小鼠体重偏低(Poga-βKO小鼠空腹血糖和随机血糖无显著差异;oga-βKO小鼠葡萄糖耐量显著受损(Poga-βKO小鼠血清胰岛素降低(Poga-βKO小鼠胰岛细胞凋亡增加。2.在高糖饮水造模下,oga-βKO小鼠血糖无差异,但oga-βKO雌鼠和雄鼠体脂率升高(Poga-βKO雌鼠体重偏高(Poga-βKO雌鼠糖耐量受损程度更严重(Poga-βKO雄鼠体重、血糖、O消耗、CO释放量、RER、产热以及各外周脂肪含量无显著差异。另外,在45周龄时该雄鼠糖耐量受损,而75周龄时糖耐量恢复,并且在80周龄时出现胰岛素耐量受损(Poga-KO和INS1-oga-KO细胞系。MIN6-oga-KO细胞胰岛素及胰岛素转录因子Neuro D1的m RNA水平表达降低(Poga-KO细胞胰岛素及胰岛素转录因子PDX-1和Neuro D1的m RNA水平表达降低(Poga的缺失可造成β细胞功能损伤。另外MIN6细胞oga敲除后,线粒体DRP1表达升高,提示oga的缺失可促进DRP1向线粒体募集。【结论】1.小鼠胰岛β细胞oga敲除可通过促进

关键词： O-GlcNAc糖基化修饰 oga 胰岛β细胞 DPR1 线粒体动力学

利用CRISPR/Cas9系统建立成体心肌细胞特异性oga基因敲除小鼠模型

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实验动物科学 2023年第6期40卷 59-66页

作者：辛充徐京平常劲王凡王剑杨晓李振华辽宁大学生命科学学院沈阳110031 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所北京102206 中国人民解放军总医院北京100039

目的利用腺相关病毒9(AAV9)介导的CRISPR/Cas9系统构建成体心肌细胞特异性oga基因敲除小鼠模型,来研究内源性oga在成体心脏稳态维持中的功能。方法首先,筛选靶向oga编码区的有效sgRNA,构建包装表达有效sgRNA的AAV9病毒。其次,建立心... 详细信息

目的利用腺相关病毒9(AAV9)介导的CRISPR/Cas9系统构建成体心肌细胞特异性oga基因敲除小鼠模型,来研究内源性oga在成体心脏稳态维持中的功能。方法首先,筛选靶向oga编码区的有效sgRNA,构建包装表达有效sgRNA的AAV9病毒。其次,建立心肌细胞特异性SpCas9表达小鼠(α-MHC^(Cas9)),并通过腹腔注射方式将AAV9-sgoga注射到小鼠体内。通过qPCR和Western blot印记杂交实验检测oga的表达情况,确定oga敲除是否成功。最后,通过组织学分析心脏结构,以及超声心动图分析心脏功能,来分析oga对心脏稳态维持的影响。结果筛选到2条可以有效靶向oga编码区的sgRNA,通过AAV9递送实现了oga基因在心脏组织的有效敲除,且导致O-GlcNAcylation表达显著上升;组织学分析和超声心动图分析发现基因敲除小鼠心脏结构及功能在基础水平与对照小鼠无显著变化。结论利用AAV9介导的CRISPR/Cas9系统成功建立了成体心肌细胞oga基因敲除的小鼠模型,为研究oga介导的O-GlcNAcylation清除在心脏稳态维持中的功能和机制提供了有效的小鼠模型。

关键词： CRISPR/Cas9 oga O-GlcNAcylation AAV9 心肌细胞

oga在炎症相关性结直肠癌演变过程中的作用研究

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OGA在炎症相关性结直肠癌演变过程中的作用研究

作者：赵玉西北大学

学位级别：硕士

背景及目的:结直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤,结肠炎（colitis）或炎性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）作为一种反复发作的慢性炎症,是CRC的高危因素之一。炎症相关性结直肠癌（colitis-associated cancer,CAC）是典型... 详细信息

背景及目的:结直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤,结肠炎（colitis）或炎性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）作为一种反复发作的慢性炎症,是CRC的高危因素之一。炎症相关性结直肠癌（colitis-associated cancer,CAC）是典型的炎症相关的结肠肿瘤,除了传统的手术、放疗、化疗及免疫治疗,中医药治疗在其中也发挥了不可替代的作用,但因其研究方法的局限性,有价值的临床数据较为缺乏,使其难以被广泛接受和认可。合适的动物模型能最大化的指导肿瘤临床治疗,用于药物敏感性测试,寻找作用靶点,从而进行精准化治疗。近年来研究表明,异常的O-GlcNAc糖基化修饰在CAC进展中的地位越来越受到重视,目前关于O-GlcNAc水解酶oga在结直肠癌疾病进展中研究较少,且在CAC中的作用尚不清楚,本课题拟构建oga肠上皮特异敲除（oga-IKO）小鼠模型,在该模型基础上诱导CAC,讨论oga敲除对CAC发生发展的影响,对评价中药抗肿瘤疗效机理提供更可靠的基础研究。研究方法:1.根据Cre/Loxp系统原理,构建oga-IKO小鼠模型。2.在oga-IKO小鼠模型基础上使用氧化偶氮甲烷（AOM）与葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导CAC。观察表型并通过Western Blot、q RT-PCR等方法对小鼠炎症和肿瘤相关指标进行检测。3.采用16S rDNA高通量测序技术对炎症相关性结直肠癌小鼠进行肠道细菌种类和丰度检测,分析肠上皮特异敲除oga对小鼠肠道菌群的影响。4.采用IHC与q RT-PCR方法检测oga、OGT、O-GlcNAc在人结肠癌组织与癌前病变组织中的表达情况,分析其与结直肠癌发生和发展的关系。5.选取人CRC细胞系HCT-116和RKO,利用慢病毒感染方法,构建oga敲减细胞系。采用q RT-PCR和Western blot等实验方法验证oga的敲减效率,并利用CCK8法、平板克隆、细胞划痕及Transwell等方法检测oga敲减对结肠癌细胞增殖与转移功能的影响。结果:1.成功构建oga-IKO小鼠模型。2.小鼠结直肠癌诱导实验结果表明,与野生型（Wild Type,WT）小鼠相比,oga肠上皮特异敲除组（Intestinal Knockout,IKO）小鼠的成瘤率明显下降（IKO组77.8%vs WT组100%,P＜0.05）;存活率显著升高（IKO组92%vs WT组66%,P＜0.0 5）;肠上皮组织破坏程度较轻,炎症因子IL-6、IL-10表达降低,TNF-α表达没有显著性差异,提示肠上皮特异敲除oga减少了炎症相关性结直肠癌的发生。3.16S rDNA测序发现,CAC诱导后,oga肠上皮特异敲除小鼠的菌群多样性增加,菌群的构成也发生了明显改变。与野生型小鼠相对比,IKO+AOM+DSS组小鼠中Bifidobacteriale（双歧杆菌属）及Saccharibacteria（糖化菌属-TM7）抗炎菌相对丰度显著增加,Enterococcus（肠球菌属）、Pasteurellales（巴斯德氏菌属）、Lactococcus（乳酸乳球菌属）等促炎相关菌丰度降低,可能与oga肠上皮特异敲除后肠道炎症反应减轻有关。4.相比于癌旁组织,oga、OGT、O-GlcNAc在人结肠癌组织中表达升高;在结肠癌癌前病变组织中的表达结果显示,oga在正常肠上皮、低级别上皮内瘤变（L）、高级别上皮内瘤变、结直肠癌组织中的阳性表达率分别为38.5%（5/13）、54.55%（6/11）、90%（9/10）、92.8%（13/14）;OGT在正常肠上皮、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、结直肠癌组织中的阳性表达率分别为30.70%（4/13）、63.60%（7/11）、90%（9/10）、92.8%（13/14）;O-GlcNAc在正常肠上皮、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、结直肠癌组织中的阳性表达率分别为84.60%（10/13）、45.4%（5/11）、90%（9/10）、85.70%（12/14）。5.成功构建结肠癌细胞HCT-116和RKO oga敲减细胞系模型。oga敲减后细胞系中oga表达水平降低,OGT代偿下降,O-GlcNAc糖基化水平升高。细胞功能实验结果显示oga敲减后,减少了HCT116和RKO细胞的增殖和迁移的能力。结论:1.小鼠肠上皮特异敲除oga显著减少AOM+DSS诱导的CAC的发生。2.肠上皮oga特异敲除后可能通过改变小鼠肠道菌群结构抑制CAC的发生与发展。***、OGT及其调控的O-GlcNAc糖基化修饰在人结直肠癌的恶性演变过程中起着重要作用。***敲减抑制结肠癌细胞HCT116和RKO的增殖和迁移。

关键词： oga O-GlcNAc糖基化肠上皮特异敲除癌前病变炎症相关性结直肠癌肠道菌群

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胰岛β细胞oga特异性敲除对糖代谢的影响

胰岛β细胞OGA特异性敲除对糖代谢的影响

作者：潘亚楠西北大学

学位级别：硕士

背景和目的:糖尿病是一种复杂的代谢失调疾病,但临床上关于糖尿病的总体疗效仍不理想,糖尿病致残率和致死率依然很高,因而寻找有效的药物意义深远,中药含有多种有效成分可以高效保护胰岛β细胞,调节糖脂代谢和信号通路,降低血糖,改善胰... 详细信息

背景和目的:糖尿病是一种复杂的代谢失调疾病,但临床上关于糖尿病的总体疗效仍不理想,糖尿病致残率和致死率依然很高,因而寻找有效的药物意义深远,中药含有多种有效成分可以高效保护胰岛β细胞,调节糖脂代谢和信号通路,降低血糖,改善胰岛素抵抗,对糖尿病及其并发症有显著的疗效。新近研究发现O-Glc NAc糖基化修饰异常与糖脂代谢紊乱密切相关。本课题构建了胰岛β细胞O-Glc NAcase（oga）特异性敲除小鼠模型,分别在常规饲养条件下和高糖饮水条件下观察小鼠胰岛β细胞oga敲除（Knockout,KO）小鼠对糖代谢的影响,为深入研究中药的降糖作用和开发降糖新药提供合适的动物模型,对以后评价中药以及中药单体对于糖尿病的疗效作出更加准确的研究基础。方法:1.运用Cre-Lox P重组酶系统构建胰岛β细胞oga特异性敲除小鼠模型,并运用琼脂糖凝胶电泳和免疫组织化学染色法验证基因敲除效果。2.分别在常规饮食条件下和高糖饮水条件下,通过空腹血糖和体重监测,以及腹腔注射葡萄糖耐量实验（Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）、腹腔注射胰岛素耐量实验（Intraperitoneal insulin tolerance test,IPITT）观察胰岛β细胞oga缺失对葡萄糖代谢稳态及胰岛素敏感性的影响。3.通过血清多因子检测试剂盒检测胰岛素、胰高血糖素等多项代谢相关内分泌调节激素水平。4.代谢笼监测小鼠代谢特征改变,包括呼吸交换率、活动量、进食量、饮水量等指标。5.通过16S r DNA测序观察小鼠肠道微生态的改变。结果:1.琼脂糖凝胶电泳和免疫组化结果显示,与野生（Wild type,WT）对照小鼠相比,KO组小鼠胰岛β细胞oga基因敲除,oga蛋白表达水平显著降低,O-Glc NAc糖基化表达水平升高;TUNEL染色发现KO组胰岛内凋亡细胞比例增加。2.常规饲养小鼠血糖及体重监测显示,年轻小鼠KO组血糖与WT组差异不明显,老龄时KO组血糖则显著高于WT组血糖（P＜0.05）;年轻小鼠KO组与WT组相比体重偏低,并于老龄时体重显著大于WT组（P＜0.05）;KO组糖耐量曲线下面积显著大于WT组（P=0.012）,IPGTT显示KO组糖耐量受损,但IPITT两组间差异不显著;小鼠血清代谢相关内分泌调节激素检测,KO组胰岛素均值为1899.8 ng/m L,WT组胰岛素均值为4274.0 ng/m L,KO组较WT组显著减低（P=0.017）;KO组瘦素均值为1014.7 ng/m L,WT组小鼠瘦素均值为375.5 ng/m L,KO组瘦素较WT组显著升高（P=0.045）,而两组间胰高血糖素、抵抗素等其他6项代谢相关内分泌调节激素未见显著性差异（P＞0.05）;进一步代谢笼监测结果显示,KO组小鼠消耗量、二氧化碳生成量、产热、进食量和饮水量较WT组均显著增加（P＜0.05）。3.高糖饮水小鼠血糖和体重变化趋势与常规饲养小鼠趋势相一致,KO组血糖和体重上升更加迅速;高糖饮水24周后,KO组胰岛素耐量曲线下面积显著大于WT组（P=0.005）,IPITT实验结果显示,KO组胰岛素敏感性显著降低;高糖饮水小鼠血清代谢相关内分泌调节激素检测发现,高糖饮水4周后,KO组胰岛素均值为3158.5ng/m L,WT组胰岛素均值为6956.5 ng/m L,KO组胰岛素较WT组显著减低（P=0.040）,KO组瘦素均值为1119.0 ng/m L,WT组瘦素均值为534.9 ng/m L,KO组小鼠瘦素较WT组显著升高（P=0.018）,此外,KO组小鼠血清胰高血糖素较WT组小鼠显著减低（P=0.0148）,抵抗素较WT组小鼠显著升高（P=0.041）。对高糖饮水4周小鼠进行代谢笼监测发现,KO组小鼠摄食、饮水量较WT组均显著增加（P＜0.05）。4.16S r DNA测序结果WT组小鼠比KO组小鼠菌群分布较均匀,与常规饲养小鼠相比高糖饮水后小鼠菌群群落变得更加复杂。同时在分类分析情况中门水平上KO组小鼠Bacteroidetes/Firmicutes（F/B）高,Bacteroidetes减少,Firmicutes增多。结论:1.胰岛β细胞oga特异性敲除小鼠O-Glc NAc糖基化水平升高,胰岛β细胞功能受损,胰岛素分泌减低,糖耐量异常。2.高糖饮水诱导条件下,胰岛β细胞oga特异性敲除小鼠糖代谢紊乱更加显著。3.高糖饮水后胰岛β细胞oga特异性敲除小鼠加重了糖代谢紊乱从而使菌群群落变得更加复杂,出现某些与代谢紊乱相关菌群表达丰度改变,提示小鼠肠道菌群失调可能与胰岛β细胞oga特异性敲除小鼠糖代谢紊乱密切相关。

关键词： O-GlcNAc糖基化修饰 oga 糖尿病胰岛β细胞

O-GlcNAc水解酶oga在溃疡性结肠炎中的作用和机制研究

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O-GlcNAc水解酶OGA在溃疡性结肠炎中的作用和机制研究

作者：张浩浩中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

背景和目的:异常的O-Glc NAc糖基化修饰与炎症相关性疾病关系密切。在oga肠上皮特异敲除(oga intestine-specific knockout,oga-IKO)小鼠模型的基础上探讨oga对溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)的作用及机制。方法:1.溃疡性结肠炎(U... 详细信息

背景和目的:异常的O-Glc NAc糖基化修饰与炎症相关性疾病关系密切。在oga肠上皮特异敲除(oga intestine-specific knockout,oga-IKO)小鼠模型的基础上探讨oga对溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)的作用及机制。方法:1.溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)患者样本收集:尊重患者意愿并签署知情同意书,在结肠镜下用活检钳钳取溃疡和远离病灶的正常黏膜组织各2-3块。采用Western Blot和免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)的方法观察oga、OGT和O-Glc NAc蛋白在UC和正常结肠黏膜组织中的表达情况。2.利用Cre/Lox P重组酶系统,将oga-Flox小鼠和oga-Kin小鼠分别与VilinCre工具小鼠进行交配以构建oga-IKO和oga-IKI小鼠模型。3.采用葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium,DSS)溶液自由饮水的方法对8-10周龄小鼠进行结肠炎诱导,观察oga-IKO小鼠和同窝对照oga-Flox小鼠的结肠炎表型,通过HE和q RT-PCR结果评价小鼠结肠组织损伤和炎症程度。4.采用慢病毒转染技术在人正常结肠上皮细胞系(NCM460)中构建oga敲减和过表达的细胞系。5.采用流式细胞技术观察oga敲减后对细胞周期和凋亡的影响;在透射电镜下观察oga敲减后对NCM460细胞系和小鼠结肠上皮细胞超微结构的影响;探讨oga敲减后内质网应激相关蛋白的变化及其参与结肠炎症的潜在机制。6.基于16S r DNA测序技术,探究oga肠上皮特异敲除对小鼠肠道菌群多样性和主要物种丰度的影响,并分析oga肠上皮特异敲除通过改变肠道菌群影响UC的潜在机制。结果:1.相对于正常结肠黏膜,溃疡性结肠炎黏膜组织中oga、O-Glc NAc和OGT蛋白的表达水平均明显升高。2.成功构建了oga-IKO和oga-IKI小鼠模型。Western Blot验证发现在ogaIKO小鼠肠道组织中oga表达水平明显降低,总体O-Glc NAc水平升高,同时OGT表达水平代偿性降低;在oga-IKI小鼠肠道组织中oga表达水平升高,但未观察到O-Glc NAc和OGT水平有明显改变。同样通过免疫组化的方法也分别观察到oga表达水平的降低和升高。3.对小鼠进行结肠炎诱导后,观察发现oga-IKO小鼠对DSS诱导结肠炎的敏感性降低。与oga-Flox小鼠相比,oga-IKO小鼠体重下降比例、炎症活动指数及结肠缩短程度均低于对照组,差异具有统计学意义。DSS造模小鼠结肠的HE染色结果显示:相对于野生对照小鼠,oga-IKO小鼠结肠上皮损伤程度较轻,结肠黏膜破坏范围较小,炎性细胞浸润也相对不明显。q RT-PCR检测小鼠结肠样本,结果显示:oga-IKO组小鼠炎症因子TNFα、IL-6和IL-1β表达水平均低于对照组,提示结肠上皮中oga的缺失在DSS诱导的结肠炎中发挥保护作用。4.成功构建了oga敲减和过表达的NCM460细胞系。oga敲减和过表达的细胞系中oga、OGT和O-Glc NAc变化与oga-IKO和oga-IKI结果一致,即:oga敲减后细胞系中oga表达水平降低,总体O-Glc NAc水平升高,OGT表达水平代偿性下降;在oga过表达的细胞系中oga表达升高明显,同样未观察到O-Glc NAc和OGT的蛋白水平发生明显改变。***敲减后细胞凋亡比例明显增加,细胞周期未发生明显变化,内质网增生明显,细胞微绒毛形态和长度、细胞间连接,线粒体、细胞核等亚细胞结构无明显改变;进一步实验结果显示内质网应激(ER Stress)相关蛋白PERK和Calnexin的表达水平下降,而CHOP蛋白表达水平升高。提示oga缺失可能通过影响内质网功能从而参与调控结肠的炎症反应。6.通过对12周龄的oga-IKO和oga-Flox小鼠进行肠道菌群16S r DNA测序发现oga-IKO小鼠的菌群多样性增加,菌群的构成也发生了明显改变,已知有抑制炎症作用的毛螺菌(Lachnospiraceae)丰度显著增加,与炎症正相关的细菌韦荣球菌(Veillonellaceae)和Negativicute丰度显著下降。提示oga肠上皮缺失通过改变菌群结构抑制肠道炎症。结论:肠上皮oga特异敲除在结肠炎中发挥保护作用。小鼠肠上皮oga特异敲除能减轻DSS诱导的结肠炎,进一步研究发现oga缺失可能通过促进损伤细胞的凋亡、影响内质网功能和改变小鼠肠道菌群谱来参与结肠炎症反应。同时在临床样本中也证实了oga、OGT和O-Glc NAc的蛋白表达水平与溃疡性结肠炎关系密切,这些发现为寻找治疗溃疡性结肠炎的靶点提供了新的思路。

关键词： oga O-GlcNAc 溃疡性结肠炎内质网应激肠道菌群

本州岛东北地区oga半岛上岩墙群的古地磁研究

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地球物理学进展 1988年第1期 97-104页

作者： Toshiyoki Tosha 郝天珧

对侵入oga半岛两组地层中的14个岩墙进行了古地磁研究,其中七个岩墙的稳定剩磁为正向磁化,六个为反向磁化,还有一个为过渡方向。正、反向磁化岩石及侵入地层之间没有观察到明显的方向上的差别。岩脉趋北东向,具有4°的标准偏移。除了一... 详细信息

对侵入oga半岛两组地层中的14个岩墙进行了古地磁研究,其中七个岩墙的稳定剩磁为正向磁化,六个为反向磁化,还有一个为过渡方向。正、反向磁化岩石及侵入地层之间没有观察到明显的方向上的差别。岩脉趋北东向,具有4°的标准偏移。除了一个具有过渡方向的岩墙外,其它13个岩墙剩磁的平均倾角和偏角分别为:58.3°和-2.8°。与平均场相应的磁极位置和在该半岛及本州岛NE北部的中中新世地层中所观察到的很接近,脉岩岩石表现出中中新世期间的二元火山作用特征,稳定剩磁的方向及双峰态分布支持岩墙是在中新世时期侵入的观点。oga岩墙走向的优势方位反映出在本州岛东北部的构造旋转完成后中到晚中新世期间应力场的基本趋势。

关键词：岩墙群应力场 oga 中新世第三纪古地磁研究反向磁化本州岛

亚洲玉米螟乙酰葡萄糖胺水解酶（Ofoga）和转移酶（OfOGT）的基因克隆与重组表达

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亚洲玉米螟乙酰葡萄糖胺水解酶（OfOGA）和转移酶（OfOGT）的基因...

作者：周罡大连理工大学

学位级别：硕士

O-GlcNAc修饰是一种动态可逆的蛋白质糖基化修饰作用,参与生物体内许多重要生理功能。这种仅连接一个β-N-乙酰葡萄糖胺分子到靶蛋白的过程是由两种酶来实现的：即β-N-乙酰葡萄糖胺转移酶(OGT)负责将GlcNAc连接到靶蛋白丝氨酸或苏氨酸... 详细信息

O-GlcNAc修饰是一种动态可逆的蛋白质糖基化修饰作用,参与生物体内许多重要生理功能。这种仅连接一个β-N-乙酰葡萄糖胺分子到靶蛋白的过程是由两种酶来实现的：即β-N-乙酰葡萄糖胺转移酶(OGT)负责将GlcNAc连接到靶蛋白丝氨酸或苏氨酸羟基上,和β-N-乙酰葡萄糖胺水解酶(oga)负责去GlcNAc化。本研究以亚洲玉米螟5龄幼虫为对象,旨在获得农业害虫亚洲玉米螟乙酰葡萄糖胺水解酶(Ofoga)和转移酶(OfOGT)基因,实现它们的重组表达,为研究昆虫中O-GlcNAc修饰作用提供基础。论文工作获得了如下结果：(一)亚洲玉米螟Ofoga基因克隆将已报导的昆虫乙酰葡萄糖胺水解酶(oga)进行序列比对,根据比对结果,选取高度保守序列设计引物,通过RT-PCR和RACE技术,从亚洲玉米螟五龄幼虫中获得Ofoga cDNA全序列,其长度为3541bp,其中5’-非编码区的长度为241bp,编码区的长度为3165bp,编码1055个氨基酸,3’-非编码区的长度为132bp, GeneBank登录号为JQ666007;(二)亚洲玉米螟Ofoga基因的重组表达、纯化及酶学性质表征Ofoga基因连接到原核表达载体pET28a上,转入大肠杆菌BL21(DE3) plysS中获得重组菌。经IPTG诱导得到了带有6个组氨酸标签的重组酶,并利用Ni-NTA Agarose亲和柱进行了纯化。Ofoga的理论分子量为118kDa,预测等电点pI为5.12;而在变性条件下,SDS-PAGE显示其分子量约为130kDa;以pNP-GlcNAc为底物时,重组Ofoga的酶催化最适pH为5.5,最适温度为55℃。(三)亚洲玉米螟OfOGT基因的克隆与重组表达将已报导的昆虫乙酰葡萄糖胺转移酶(OGT)进行序列比对,根据比对结果,选取高度保守序列设计引物,通过RT-PCR和RACE技术,从亚洲玉米螟五龄幼虫中获得OfOGT基因编码区,其长度为3177bp,编码1058个氨基酸。利用ProtParam软件预测OfOGT其分子量大小约为118kDa,等电点为6.31。将OfOGT基因连接到原核表达载体pET28a中转入大肠杆菌宿主BL21(DE3) plysS进行重组表达,通过SDS-PAGE得到大小约为118kDa的可溶蛋白。

关键词： O-GlcNAc OGT oga 重组表达亚洲玉米螟

O-GlcNAc修饰水平变化对牛卵母细胞体外成熟的影响

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畜牧兽医学报 2022年第11期53卷 3856-3865页

作者：王腾飞冯志强孙雅雯赵善江郝海生邹惠影杜卫华赵学明朱化彬庞云渭中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

旨在探究O-β-N-乙酰葡糖胺(O-linked beta-N-acetylglucosamine,O-GlcNAc)修饰水平变化对牛卵母细胞体外成熟的影响。本研究以牛卵母细胞为研究对象,检测O-GlcNAc转移酶(O-GlcNAc transferase,OGT)、O-GlcNAc糖苷酶(O-GlcNAcase,oga)及O-GlcNAc蛋白在牛体外成熟卵母细胞中的分布;将卵丘-卵母细胞复合体分别在添加4 mmol·L^(-1) OGT抑制剂BADGP和100μmol·L^(-1) oga抑制剂PUGNAc的体外成熟液中进行体外成熟,将未添加组作为对照组,分别统计各组卵母细胞第一极体排出率和体外受精胚胎发育率,并采用荧光定量PCR和Western blot检测O-GlcNAc蛋白、OGT、oga、GFAT和TXNIP的mRNA和蛋白表达。结果表明,OGT和O-GlcNAc蛋白共定位于牛体外成熟卵母细胞的细胞质和细胞核中,而oga和O-GlcNAc蛋白共定位于体外成熟卵母细胞的细胞质中,且相对集中在卵母细胞的皮质区。与对照组相比,BADGP处理组和PUGNAc处理组卵母细胞第一极体排出率((52.8±5.1)%&(60.9±1.9)%vs.(70.8±5.4)%)和体外受精囊胚发育率((9.6±4.9)%&(10.0±5.8)%vs.(21.5±4.3)%)均显著降低(Poga的表达降低;而在PUGNAc处理组中,卵母细胞oga的表达显著下调,O-GlcNAc修饰水平升高,OGT的蛋白表达显著减少;抑制OGT显著上调己糖胺生物合成途径关键限速酶GFAT mRNA的表达,而抑制oga则显著下调GFAT mRNA的表达;此外,O-GlcNAc修饰水平改变显著上调了葡萄糖调控关键因子TXNIP的表达。研究结果表明,O-GlcNAc修饰水平改变会降低牛卵母细胞体外成熟及发育能力,卵母细胞通过反馈调节OGT、oga、GFAT以及TXNIP的表达,应对O-GlcNAc修饰水平的波动。

关键词：牛卵母细胞 O-GlcNAc修饰 OGT oga

O-GlcNAcylation糖基化修饰在非酒精性脂肪性肝炎中的作用及机制探讨

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O-GlcNAcylation糖基化修饰在非酒精性脂肪性肝炎中的作用及机制...

作者：张杰濠中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

背景:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种常见的慢性肝脏代谢性疾病,其严重形式非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)表现为肝脏脂肪变性、炎症反应、气球样变和纤维化。流行病学... 详细信息

背景:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种常见的慢性肝脏代谢性疾病,其严重形式非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)表现为肝脏脂肪变性、炎症反应、气球样变和纤维化。流行病学研究表明,超过20%的NASH患者会发展为肝硬化甚至肝癌。同时,NASH还是肥胖、糖尿病等代谢性疾病以及心梗、动脉粥样硬化、脑卒中等心脑血管疾病的独立危险因素。肝脏从单纯脂肪变性发展到NASH是一个多因素共同参与的过程。脂质代谢紊乱导致肝脏脂肪变性及脂毒性物质累积,伴随着细胞应激损伤与细胞死亡,损伤相关分子模式释放,炎性细胞激活等多种因素,促进了肝脏由单纯脂肪变性向以炎症纤维化为特征的NASH的进展,但其具体过程及调控机制仍有待深入研究。作为一种重要的蛋白翻译后修饰方式,O-GlcNAcylation糖基化在体内参与了多种生命过程的调控,例如细胞内信号转导、基因表达调控、细胞能量代谢、细胞应激及细胞死亡等多种过程。O-GlcNAcylation糖基化修饰由糖基转移酶(O-GlcNAc transferase,OGT)和糖基水解酶(O-GlcNAcase,oga)所调控,其平衡的破坏导致了多种疾病的发生。但是,O-GlcNAcylation糖基化修饰在NASH发生发展中的作用仍不明确,尤其是在NASH炎症反应中发挥何种调控作用仍有待研究。目的:(1)通过构建NASH动物模型和细胞模型,探究O-GlcNAcylation糖基化修饰在NASH发生发展中的作用。(2)利用蛋白质组学技术鉴定O-GlcNAcylation糖基化修饰靶蛋白,筛选可能在NASH中发挥作用的O-GlcNAcylation糖基化蛋白并进行验证。方法:(1)利用课题组前期构建的oga肝细胞特异性敲除(hepatocyte-specific oga knockout,oga-LKO)小鼠,分别给予oga-LKO小鼠和同窝对照小鼠胆碱蛋氨酸缺乏(methionine-choline deficient,MCD)饮食诱导NASH模型,造模结束后采用HE染色、油红O染色及天狼星红染色评价小鼠肝脏脂肪变性与纤维化程度。同时检测血清丙氨酸转氨酶ALT、天冬氨酸转氨酶AST,进行肝脏F4/80免疫组化染色,以判断炎症损伤程度。(2)利用棕榈酸(palmitic acid,PA)处理HepG2细胞,建立NASH细胞模型,随后用oga抑制剂TMG处理以提高O-GlcNAcylation糖基化水平,在体外探究O-GlcNAcylation糖基化对细胞脂滴生成及炎症损伤的影响。通过油红O染色观察细胞内脂滴,检测上清ALT、AST含量及细胞炎症因子表达水平以评价炎症损伤程度。(3)给予SK-Hep-1细胞TMG处理后,利用质谱鉴定差异表达蛋白。同时,利用O-GlcNAcylation糖基化抗体RL2进行免疫沉淀富集O-GlcNAcylation糖基化修饰靶蛋白并进行质谱检测。综合分析两次质谱结果,寻找下游O-GlcNAcylation糖基化靶分子并加以验证。结果:(1)oga肝细胞敲除导致O-GlcNAcylation糖基化水平明显升高,HE染色和油红O染色显示,oga敲除加重了 MCD饮食诱导的肝脏脂肪变及炎症反应。F4/80免疫组化结果表明,MCD饮食诱导下,oga-LKO组巨噬细胞数目明显增多,同时可见数目更多的炎症细胞灶。ALT、AST检测表明,oga-LKO组肝损伤程度更重。(2)给予HepG2细胞PA刺激可以提高细胞O-GlcNAcylation糖基化水平。同时,PA作为游离脂肪酸可以模拟NASH情况下的脂毒性刺激,促进肝细胞脂肪变与炎症损伤。而抑制oga可以加重PA诱导的肝细胞脂滴生成与炎症损伤。(3)SK-Hep-1细胞给予TMG刺激后O-GlcNAcylation糖基化水平显著升高,质谱分析结果表明,与对照组相比,TMG处理组中上调的蛋白有187个,表达下调的蛋白有224个。免疫沉淀共富集到221个糖基化蛋白,这些蛋白主要富集在RNA代谢、蛋白质翻译、转录因子等相关通路。由于O-GlcNAcylation糖基化修饰可以通过抑制目的蛋白的泛素化以增加靶蛋白稳定性,提高蛋白表达水平,因此我们将TMG处理后表达上调的蛋白与IP联合质谱获得的蛋白取交集,得到了 18个候选的O-GlcNAcylation糖基化蛋白,在其中发现了在NASH中介导炎症反应的重要分子HMGB1。通过Western blot和Co-IP实验,证实了 O-GlcNAcylation糖基化升高后HMGB1蛋白表达水平上升。免疫共沉淀证实HMGB1可以被RL2抗体所富集,提示HMGB1存在O-GlcNAcylation糖

关键词：非酒精性脂肪性肝炎 O-Glc NAcylation糖基化 HMGB1 OGT oga