两种药物抗炎止痒作用及其分子机理研究

作     者：向雪川 

作者单位：中南民族大学 

学位级别：硕士

导师姓名：梅之南

授予年度：2021年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：氧化苦参碱 热休克蛋白90 热休克蛋白60 角质形成细胞 冰片 巨噬细胞 

摘      要：瘙痒最初是德国医生Samuel Hafenreffer定义的“一种令人不快的感觉,它引发了为了消除有害刺激物而进行抓挠的想法。瘙痒的分子机理复杂,造成瘙痒的原因多种多样。一般认为,与瘙痒相关的细胞主要包括角质细胞和免疫细胞,它们释放出各种代谢产物产生过敏性瘙痒并引起各种炎性皮肤病。在“瘙痒——搔抓——痒的循环中,瘙痒加剧,炎症加重,患者的正常生活受到严重影响。目前治疗慢性瘙痒的药物仅简单地分为局部用药和全身性治疗,包括润肤剂和保湿剂、麻醉剂、冷却剂和糖皮质激素等和抗组胺药、神经活性药物、抗抑郁药和光疗等。但长时间使用抗生素、免疫抑制剂及糖皮质激素难以避免药物的副作用,且病症易复发。现国内有多种中医疗法,可以缓解病症减轻副作用,提高疗效。常用中药包括甘草、防风、荆芥、白芷、黄连、苦参、蛇床子、白鲜皮、冰片等。本研究中,在C57 BL/6小鼠上建立了IMQ诱导的银屑病模型和SADBE诱导的ACD模型两种慢性痒模型,以氧化苦参碱（OMT）和冰片为例,探究其抗炎止痒作用及其分子机理。首先建立了IMQ模型探究OMT的止痒抗炎作用及机理。动物行为学结果显示,OMT在IMQ模型中表现出显著的止痒功效。通过蛋白印迹法、RT-PCR技术检测皮肤组织中四种热休克蛋白（HSP）的表达,并通过免疫组化、免疫荧光染色技术直观地检测热休克蛋白的表达与定位。结果显示,OMT通过降低角质细胞中HSP90与HSP60的表达从而起到对银屑病小鼠的止痒作用。体内实验中,通过H＆E染色、甲苯胺蓝染色等形态学实验,OMT显示能够显著改善小鼠IMQ模型造模皮肤的炎症表型。通过RT-PCR实验,发现OMT能降低银屑病小鼠皮肤组织中银屑病标志性炎性因子如IL-17、IL-22、IL-23、TNF-α和IL-6的mRNA水平表达。通过蛋白印迹法,发现OMT能降低皮肤组织中MAPK通路信号分子的蛋白表达。体外实验中,通过TNF-α和IFN-γ建立了细胞炎症模型。在使用OMT后,炎性因子的mRNA表达都显示下降,p-P38和p-ERK的蛋白表达也显示出OMT与MAPK抑制剂U0126有相近的抑制作用。通过siRNA技术使细胞中HSP90和HSP60的表达沉默后,再检测炎性因子的表达时发现,HSP90和HSP60的敲低可以逆转炎性因子的表达。以上说明OMT通过降低角质细胞中HSP90和HSP60的表达,抑制MAPK信号通路和炎性因子的表达从而发挥抗炎作用。另外构建了SADBE模型探究冰片抗炎作用的机理。应用RT-PCR和Elisa技术检测冰片对炎性因子的影响,结果显示冰片能有效抑制耳朵组织中炎性因子的表达,免疫组化结果显示,冰片能下调中性粒细胞、树突细胞和M1型巨噬细胞的表达。流式细胞术检测显示与免疫组化相同的趋势,冰片可以抑制耳朵组织中树突细胞和巨噬细胞的表达。利用LPS诱导巨噬细胞建立体外炎症细胞模型,发现冰片能抑制LPS对M1型巨噬细胞的活化,抑制原代巨噬细胞中IL-6mRNA表达,并下调MAPK通路的蛋白分子表达。以上结果提示,冰片能抑制免疫细胞的活化,下调促炎因子的表达,阻止M1型巨噬细胞的活化,下调IL-6 mRNA水平。综上所述,本研究证明了OMT和冰片具有抗炎止痒效果并探究了其作用机理。OMT通过调控角质细胞中的HSP90和HSP60的表达,抑制银屑病的瘙痒;抑制MAPK信号通路和抑制炎性因子的表达,发挥抗炎作用。冰片能抑制树突细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的活化,并通过抑制M1型巨噬细胞的活化,抑制IL-6对M1型巨噬细胞的极化,下调MAPK信号通路的表达,发挥抗炎作用。通过本研究,OMT和冰片的抗炎止痒药理作用与其分子生物学机理得到进一步证实,为其发挥临床效用提出重要参考,具有良好的临床应用前景。