单增李斯特菌快速检测方法研究及致病菌共增菌培养基的研制

作     者：谢楠楠 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙春燕

授予年度：2021年

学科分类：09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 

主      题：单增李斯特菌 大肠杆菌O157:H7 沙门氏菌 生物膜干涉 噬菌体 抗体 快速检测 共增菌培养基 

摘      要：近年来人们因进食被单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌等食源性致病菌污染的食品而引起的食源性疾病时有发生。食源性致病菌的控制与检测已经受到世界各地的高度重视。快速准确的检测及控制技术对于预防由食源性致病菌引起的疾病和死亡至关重要。而传统的致病菌检测方法往往耗时耗力,因此,灵敏便捷、准确且易于操作的快速检测方法亟需开发。通常食品中可能存在的食源性致病菌的数量往往比较少,为保证检测结果的准确性,需要进行前增菌。由于不同种类致病菌其营养要求不尽相同,前增菌后的样品只能用于单一食源性致病菌的检测,这就极大地限制了高通量检测技术在食源性致病菌检测中的应用。为提升致病菌的检测效率,开发一种能够同时使多种食源性致病菌等速快速增殖的通用增菌培养基是非常有必要的。本研究第一部分以单增李斯特菌为目标菌,利用抗体和噬菌体这两种特异性生物识别元件,建立了基于生物膜干涉技术(BLI)的快速检测方法。第二部分研制了一种能使单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌等速快速增殖的通用增菌培养基。主要研究内容及结果如下:(1)基于BLI技术的单增李斯特菌实时无标记快速检测方法的建立。(1)以抗体为识别元件。探究了第二代氨基偶联传感器表面抗体固定时的相关条件,确定了方法的检出限,分析了方法的特异性。抗体固定化时HAc-Na Ac缓冲液的最佳p H为4,抗体最佳固化浓度为50μg/m L。结合时间在3 min、6 min、9min和12min时所对应的单增李斯特菌的最低检出限分别是4.60×10、1.20×10、1.00×10和7.83×10CFU/m L。该方法具有特异性。(2)以噬菌体为识别元件。探究了链霉亲和素传感器表面噬菌体固定时的相关条件以及此方法的检出限。修饰噬菌体的生物素化试剂最佳浓度为2%(v/v),噬菌体最佳效价为10PFU/m L。结合时间为3 min、6 min和9 min时,单增李斯特菌检出限分别为3.89×10、2.25×10和1.35×10CFU/m L。(2)单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌通用增菌培养基的研制。经过单因素试验挑选出最佳的促进剂和抑制剂,经正交试验进行优化,得出单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌通用增菌培养基(LES)配方:胰胨17 g/L、酵母浸膏6.0 g/L、磷酸氢二钾2.5 g/L、磷酸二氢钾1.35 g/L、磷酸氢二钠9.6 g/L、氯化钠5.0 g/L、蛋白胨3.0 g/L、(月示)蛋白胨25 g/L、牛肉粉15g/L、大豆蛋白胨14 g/L、葡萄糖3 g/L、放线菌酮0.3 g/L、甘露醇3 g/L、丙酮酸钠6 g/L、吖啶黄3 mg/L、磷霉素钠3.125 mg/L。通过对单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌共增菌培养基的增菌效果进行分析,三种目标菌在LES中培养12 h后菌浓度基本都能够达到10CFU/m L以上,同时抑制非目标菌的生长。增菌后的菌浓度能够满足后续多通道BLI生物传感器、多重PCR、多通道表面等离子体激元共振生物传感器等高通量检测技术的要求。本研究构建的基于BLI技术的快速检测新方法可实现单增李斯特菌的实时无标记快速检测,所做的探索对于单增李斯特菌以外的其他食源性致病菌的快速检测也有重要指导意义。研制的通用增菌培养基可实现单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的等速快速增殖,为后续利用多通道生物分子相互作用仪等高通量检测技术同时检测上述三种致病菌打下了基础。