番茄BAG8和BAG9在响应温度胁迫中的作用

作     者：杨晨 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周杰

授予年度：2021年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090202[农学-蔬菜学] 

主      题：番茄 BAG8 BAG9 低温胁迫 高温胁迫 CBF1 光合作用 抗氧化酶 自噬 泛素化 分子伴侣 钙调蛋白 铁硫蛋白 小分子热休克蛋白 

摘      要：番茄(Solanum lycopersicum)属喜温园艺作物,具有食用和药用等价值。目前,我国设施番茄产业发展迅速,但也存在一系列问题,尤其是近年来极端低温和高温天气的频繁出现,严重影响着番茄产量和品质的提高。BAG(Bcl-2associated athanogene)是一类多功能伴侣调节蛋白,在植物中的研究相对较少且主要集中于拟南芥(Arabidopsis thaliana),被报道广泛参与调控生长发育和盐、干旱等胁迫响应途径,但在番茄中响应温度的作用机理还鲜为人知。本文鉴定了番茄的10个BAG基因,利用生物信息学手段进行了系统进化、蛋白功能和转录调控分析;以番茄为实验材料,筛选出了响应温度胁迫的主效基因BAG8和BAG9,利用生理学与分子技术探究了二者在胁迫应答中的功能;明确了BAG8、BAG9的定位和互作蛋白,并对二者的生物学功能进行了初步鉴定。主要研究结果如下:1.鉴定了番茄的10个BAG基因,明确了BAG家族广泛参与番茄响应非生物胁迫的过程。根据与拟南芥的同源性和进化关系,将鉴定出的10个BAG基因命名为Sl BAG1～10。构建了番茄、拟南芥、水稻和烟草的系统进化树并进行了氨基酸序列分析,发现Sl BAGs主要包含保守BAG结构域、类泛素UBL结构域和钙调蛋白Ca M结合基序。进一步预测分析蛋白信息和结构,发现大多数BAG均由300～400个氨基酸组成,且蛋白间所含的结构域类型及数量存在差异。转录调控分析发现BAG8基因启动子的反义链中含有低温应激反应元件,BAG9基因中含有热休克反应元件。以上结果表明,番茄BAG家族成员具有丰富的蛋白结构和生物学功能,可能通过多种途径广泛参与到非生物胁迫的应答过程中,特别是BAG8和BAG9可能在抵抗温度胁迫方面发挥了重要作用。2.筛选了番茄BAG家族在响应低温胁迫中的主效基因BAG8和BAG9,明确了二者对低温抗性的正向调控作用。对野生型番茄进行低温处理,发现有6个基因上调,其中BAG8和BAG9上调最显著;通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术构建了所有上调基因的沉默材料并进行低温处理,发现BAG8和BAG9沉默材料表现出明显的抗性减弱,关键冷害响应基因CBF1的表达受到显著抑制;净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Gr)显著降低;抗氧化酶关键基因的表达量显著降低、酶活性的升高受到抑制;自噬体数目明显减少,自噬关键基因ATG8a的表达受到抑制;泛素化蛋白积累增多。以上结果表明,低温胁迫后番茄BAG8和BAG9发挥了主要作用,二者可能参与CBF正调控抗冷途径,还可能在维持光合作用的正常运行和抗氧化防御机制稳态、影响自噬体形成以及在减缓低温胁迫诱导的蛋白泛素化积累中发挥作用,进而正调控番茄的低温抗性。3.明确了番茄BAG家族在响应高温胁迫中的表达水平和BAG8、BAG9对高温抗性的正向调控作用。在高温处理的野生型番茄中,BAG6、BAG8和BAG9的表达量与常温相比显著上调,表明BAG6、BAG8和BAG9可能在番茄参与响应高温胁迫中起作用。为进一步完善对BAG8和BAG9响应温度胁迫的作用研究,通过VIGS技术构建了二者的沉默材料。高温处理后,BAG8和BAG9沉默材料与对照相比表现出明显的热敏性;Pn、Gs和Gr显著降低;自噬体数目明显减少;总蛋白泛素化水平显著提高。这些结果表明,BAG8和BAG9正调控番茄的高温抗性,二者可能在维持植株正常光合作用、影响自噬体形成和减缓高温胁迫诱导的蛋白泛素化积累中发挥作用。4.明确了番茄中BAG8和BAG9的定位,筛选并验证了与二者互作的蛋白,初步鉴定了BAG8和BAG9的生物学功能。亚细胞定位表明,BAG8和BAG9均位于细胞核和细胞质。酵母筛库筛选出可能参与响应温度胁迫的互作蛋白有钙调蛋白(Ca M1～6)、铁硫蛋白(PGR1、Fd C1、Fd2)和小分子热休克蛋白(HSP17.7A、HSP17.7B、HSP17.6B、HSP17.6C)。酵母双杂交和Bi FC表明,BAG8与PGR1、Ca M2～4在细胞质中互作,BAG9与PGR1、Fd C1、Fd2、Ca M2～4在细胞核和细胞质中互作。进一步验证表明,BAG8、BAG9均与包含HSP17.7A、HSP17.7B、HSP17.6B、HSP17.6C的小分子热休克蛋白HSP20家族互作。以上结果表明,温度胁迫下BAG8、BAG9可能通过与钙调蛋白、铁硫蛋白或小分子热休克蛋白结合正调控番茄对温度胁迫的抗性,但具体作用机制还有待深入探究。