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番茄bag8和bag9在响应温度胁迫中的作用

番茄BAG8和BAG9在响应温度胁迫中的作用

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作者：杨晨浙江大学

学位级别：硕士

番茄(Solanum lycopersicum)属喜温园艺作物,具有食用和药用等价值。目前,我国设施番茄产业发展迅速,但也存在一系列问题,尤其是近年来极端低温和高温天气的频繁出现,严重影响着番茄产量和品质的提高。bag(Bcl-2associated athanogene)... 详细信息

番茄(Solanum lycopersicum)属喜温园艺作物,具有食用和药用等价值。目前,我国设施番茄产业发展迅速,但也存在一系列问题,尤其是近年来极端低温和高温天气的频繁出现,严重影响着番茄产量和品质的提高。bag(Bcl-2associated athanogene)是一类多功能伴侣调节蛋白,在植物中的研究相对较少且主要集中于拟南芥(Arabidopsis thaliana),被报道广泛参与调控生长发育和盐、干旱等胁迫响应途径,但在番茄中响应温度的作用机理还鲜为人知。本文鉴定了番茄的10个bag基因,利用生物信息学手段进行了系统进化、蛋白功能和转录调控分析;以番茄为实验材料,筛选出了响应温度胁迫的主效基因bag8和bag9,利用生理学与分子技术探究了二者在胁迫应答中的功能;明确了bag8、bag9的定位和互作蛋白,并对二者的生物学功能进行了初步鉴定。主要研究结果如下:1.鉴定了番茄的10个bag基因,明确了bag家族广泛参与番茄响应非生物胁迫的过程。根据与拟南芥的同源性和进化关系,将鉴定出的10个bag基因命名为Sl bag1～10。构建了番茄、拟南芥、水稻和烟草的系统进化树并进行了氨基酸序列分析,发现Sl bags主要包含保守bag结构域、类泛素UBL结构域和钙调蛋白Ca M结合基序。进一步预测分析蛋白信息和结构,发现大多数bag均由300～400个氨基酸组成,且蛋白间所含的结构域类型及数量存在差异。转录调控分析发现bag8基因启动子的反义链中含有低温应激反应元件,bag9基因中含有热休克反应元件。以上结果表明,番茄bag家族成员具有丰富的蛋白结构和生物学功能,可能通过多种途径广泛参与到非生物胁迫的应答过程中,特别是bag8和bag9可能在抵抗温度胁迫方面发挥了重要作用。2.筛选了番茄bag家族在响应低温胁迫中的主效基因bag8和bag9,明确了二者对低温抗性的正向调控作用。对野生型番茄进行低温处理,发现有6个基因上调,其中bag8和bag9上调最显著;通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术构建了所有上调基因的沉默材料并进行低温处理,发现bag8和bag9沉默材料表现出明显的抗性减弱,关键冷害响应基因CBF1的表达受到显著抑制;净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Gr)显著降低;抗氧化酶关键基因的表达量显著降低、酶活性的升高受到抑制;自噬体数目明显减少,自噬关键基因ATG8a的表达受到抑制;泛素化蛋白积累增多。以上结果表明,低温胁迫后番茄bag8和bag9发挥了主要作用,二者可能参与CBF正调控抗冷途径,还可能在维持光合作用的正常运行和抗氧化防御机制稳态、影响自噬体形成以及在减缓低温胁迫诱导的蛋白泛素化积累中发挥作用,进而正调控番茄的低温抗性。3.明确了番茄bag家族在响应高温胁迫中的表达水平和bag8、bag9对高温抗性的正向调控作用。在高温处理的野生型番茄中,bag6、bag8和bag9的表达量与常温相比显著上调,表明bag6、bag8和bag9可能在番茄参与响应高温胁迫中起作用。为进一步完善对bag8和bag9响应温度胁迫的作用研究,通过VIGS技术构建了二者的沉默材料。高温处理后,bag8和bag9沉默材料与对照相比表现出明显的热敏性;Pn、Gs和Gr显著降低;自噬体数目明显减少;总蛋白泛素化水平显著提高。这些结果表明,bag8和bag9正调控番茄的高温抗性,二者可能在维持植株正常光合作用、影响自噬体形成和减缓高温胁迫诱导的蛋白泛素化积累中发挥作用。4.明确了番茄中bag8和bag9的定位,筛选并验证了与二者互作的蛋白,初步鉴定了bag8和bag9的生物学功能。亚细胞定位表明,bag8和bag9均位于细胞核和细胞质。酵母筛库筛选出可能参与响应温度胁迫的互作蛋白有钙调蛋白(Ca M1～6)、铁硫蛋白(PGR1、Fd C1、Fd2)和小分子热休克蛋白(HSP17.7A、HSP17.7B、HSP17.6B、HSP17.6C)。酵母双杂交和Bi FC表明,bag8与PGR1、Ca M2～4在细胞质中互作,bag9与PGR1、Fd C1、Fd2、Ca M2～4在细胞核和细胞质中互作。进一步验证表明,bag8、bag9均与包含HSP17.7A、HSP17.7B、HSP17.6B、HSP17.6C的小分子热休克蛋白HSP20家族互作。以上结果表明,温度胁迫下bag8、bag9可能通过与钙调蛋白、铁硫蛋白或小分子热休克蛋白结合正调控番茄对温度胁迫的抗性,但具体作用机制还有待深入探究。

关键词：番茄 bag8 bag9 低温胁迫高温胁迫 CBF1 光合作用抗氧化酶自噬泛素化分子伴侣钙调蛋白铁硫蛋白小分子热休克蛋白

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伴侣蛋白bag9在番茄响应高温胁迫中的功能及机制研究

伴侣蛋白BAG9在番茄响应高温胁迫中的功能及机制研究

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作者：黄华敏浙江大学

学位级别：硕士

随着全球气候环境变化,高温胁迫是威胁世界粮食安全的主要生态制约因素。番茄是我国重要的园艺作物,高温严重制约了番茄的品质和产量,故研究番茄在高温胁迫下的抗性机制,创制耐高温的种质资源,对提高我国蔬菜的产量和品质具有重要意义。... 详细信息

随着全球气候环境变化,高温胁迫是威胁世界粮食安全的主要生态制约因素。番茄是我国重要的园艺作物,高温严重制约了番茄的品质和产量,故研究番茄在高温胁迫下的抗性机制,创制耐高温的种质资源,对提高我国蔬菜的产量和品质具有重要意义。bag(Bcl-2相关抗凋亡基因,Bcl-2 associated athanogene)蛋白家族是一类在动植物中进化保守的伴侣蛋白,可作为衔接蛋白与信号分子和分子伴侣形成复合物,广泛参与细胞的生命活动和逆境响应过程。近年来,许多研究发现植物中bags响应温度胁迫,但番茄中bags是否参与调控高温抗性亟待挖掘。为研究bags在番茄高温抗性中的功能及分子机制,先前在高温胁迫下对番茄bags的表达量进行分析,发现bag9在野生型番茄中显著上调,故本文以番茄为研究材料,利用植物组织培养技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术构建bag9的过表达和突变体材料,利用植物生理生化、基因工程技术、分子生物学、遗传学等手段,研究bag9在高温应答中的功能;明确bag9对植物抗氧化系统的影响;鉴定bag9与热激蛋白Hsp70的相互作用,挖掘番茄高温抗性中二者的协同调控关系。主要研究结果如下:***9增强番茄植株的高温抗性。利用组织培养技术、CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建基因功能缺失突变体bag9和过表达材料OE-bag9。在高温条件下,bag9突变体和野生型(WT)相比,对高温更加敏感,具体表现为植株萎蔫程度增加、相对离子渗透率提高、丙二醛(MDA)含量提高;光合气体交换参数中净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)降低,胞间二氧化碳浓度(Ci)升高;光系统II最大光化学效率(Fv/Fm)、光系统II光化学效率Y(II)、光化学猝灭系数q P降低。相反,OE-bag9植株的高温抗性增强。这些结果表明,bag9在增强高温胁迫下细胞膜稳定性,维持光合作用中发挥作用,缓解高温对番茄造成的伤害,增强番茄高温抗性。2.高温胁迫下bag9增强番茄植株的抗氧化能力。为解释bag9增强番茄高温抗性的生理机制,通过生理学和分子生物学技术,发现OE-bag9植株在高温胁迫下抗氧化能力提高。与WT相比,bag9植株在高温下积累了更多的活性氧(HO和O.),加剧了蛋白质氧化程度,高温诱导的关键抗氧化酶活性(CAT、APX、DHAR、GR、SOD)和热激蛋白积累受到明显抑制,GSH/GSSG及As A/DHA的比率也显著降低。而OE-bag9植株表现出相反的趋势,高温下细胞活性氧积累水平下降、蛋白氧化程度降低;活性氧清除能力提升、热激蛋白的诱导受到促进、GSH/GSSG及As A/DHA的比率上升。这些结果表明,bag9提高高温胁迫下抗氧化酶活性,提高还原型谷胱甘肽和抗坏血酸的水平,促进热胁迫下热激蛋白的积累,从而提高番茄植株抗氧化能力,降低高温胁迫下细胞中活性氧的累积和变性蛋白质的产生。3.鉴定到bag9互作蛋白Hsp70,并明确Hsp70正调控番茄高温抗性。利用酵母双杂交筛库技术挖掘出bag9伴侣蛋白的潜在互作蛋白,然后通过酵母双杂交点对点、双荧光分子互补、蛋白质体外结合技术确认热激蛋白Hsp70与bag9在细胞核和细胞质中互作。利用VIGS沉默技术在野生型(WT)背景下构建p TRV-Hsp70/WT植株,发现Hsp70沉默显著降低了番茄植株的高温抗性:和野生型WT相比,植株萎蔫程度增加、细胞膜通透性提高、光合速率降低、光系统I和光系统II功能受损、高温诱导的抗氧化酶活性和抗氧化酶基因表达受到抑制。综上所述,Hsp70在番茄高温抗性中起到正调控作用。***9与Hsp70共同调控番茄植株高温抗性。为探究bag9和Hsp70在调控高温抗性中是否具有协同性,进一步在OE-bag9中沉默Hsp70后,进行高温处理,发现Hsp70基因下调导致p TRV-Hsp70/OE-bag9植株对高温胁迫的敏感性增加,光合系统和抗氧化系统受损,细胞膜通透性增加。结果表明,bag9与Hsp70协同调控番茄植株的高温抗性。以上研究为丰富番茄高温信号传导网络,创制高温抗逆种质,提高番茄的产量和品质,提供了理论依据。

关键词：番茄 bag9 氧化还原稳态热激蛋白 Hsp70 蛋白互作高温抗性

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