Onconase偶聚化设计、优化表达及抗肿瘤活性研究
作者单位：吉林大学
学位级别：硕士
导师姓名：孙德军
授予年度：2021年
学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100701[医学-药物化学] 100602[医学-中西医结合临床]
摘 要：豹蛙酶(Onconase)是从北美洲豹蛙卵母细胞中提取出的一种核糖核酸酶,具有RNA降解活性,经FDA批准用于间皮质瘤的治疗。临床应用显示:Onconase免疫原性低、对正常组织器官损伤小,在其它肿瘤治疗方面也具有较好应用前景。然而,用于提取Onconase的北美洲豹蛙数量逐年下降,Onconase来源有限,并且我国没有引进这一物种,这在一定程度上限制了Onconase在我国的基础研究与临床应用。因此,利用基因工程技术获取Onconase具有重要意义。另有研究显示,Onconase在干燥过程中可以通过N端肽链间交换形成二聚体,其抗肿瘤效果优于单体,这有望进一步推动Onconase的研究与应用。在基因工程表达系统中,毕赤酵母表达系统已逐渐被广泛应用。该表达系统可利用的启动子种类多,其中p GAP占据重要优势。毕赤酵母采用p GAP表达外源蛋白时无需更换碳源,可以避免使用甲醇,因此发酵周期短、生产成本低、安全性高,有利于大规模生产。最为关键的是,毕赤酵母属于真核生物,对蛋白质具有加工修饰功能,同时不会产生内毒素,FDA认定其是安全的表达系统,在医药领域具有广阔的应用前景。目前,有关毕赤酵母表达Onconase偶聚体的研究鲜有报道。本研究旨在对Onconase基因进行偶聚化设计,期望通过二硫键连接方式形成偶聚体,研究其在毕赤酵母中的表达情况,同时探究其是否具有抗肿瘤活性作用。具体研究内容如下:1.重组毕赤酵母的表达体系构建将Onconase基因进行偶聚化设计,根据毕赤酵母密码子偏好性进行优化,在基因两端引入XhoⅠ及Eco RⅠ酶切识别位点,将基因片段整合至本教研室设计的p GAPZαMUT载体中,构建重组质粒p GAPZαMUT-D-ONC,双酶切结果显示重组质粒构建成功。将线性化质粒电转至毕赤酵母GS115中,利用Zeocin抗性、基因测序及SDS-PAGE筛选工程菌。摇瓶培养获取的上清利用Ni-Sepharose6FF亲和层析柱纯化,结果表明毕赤酵母成功表达出目的蛋白,利用BCA法测定其含量为102.25 mg/L。DTT还原D-ONC蛋白的结果显示,偶聚体被成功还原为单体,说明毕赤酵母表达的目的蛋白是由Onconase单链组成。2.工程菌的培养条件优化利用单因素实验及均匀设计实验研究pH、温度、转速、碳源及时间对蛋白表达的影响。先利用单因素实验进行优化,结果显示最佳pH为6.0、温度为29℃、转速为200 rpm、碳源为葡萄糖、时间为72 h。在此基础上,设计四因素六水平均匀设计实验,以蛋白浓度为指标,pH值、温度、转速及碳源浓度作为因变量,利用逐步回归分析法建立回归模型进行数据分析,结果显示碳源浓度对D-ONC表达量的影响最为显著,且各培养条件之间存在交互作用。最佳培养条件为:pH为5.6、温度为28℃、转速为220 rpm、碳源浓度为3.5%、时间为72 h,该条件下的D-ONC蛋白含量为119.03 mg/L,与未优化条件相比,蛋白含量提高16.41%。3.D-ONC中试表达与纯化基于表达条件优化结果,将工程菌在50 L发酵罐上进行发酵,利用溶氧反馈方式进行补料,72 h后停止发酵。将发酵液离心后进行抽滤,抽滤液利用截流量为10 k Da的超滤膜进行超滤浓缩,得到的截留液利用Ni-Sepharose 6FF亲和层析柱分离纯化D-ONC蛋白。结果显示,72 h时D-ONC蛋白含量最高,且经过纯化后可得到较纯的目的蛋白D-ONC,其含量为496.36 mg/L。4.D-ONC的活性检测利用MTT法分析D-ONC是否对MCF-7及Hep G2细胞具有生物活性作用。不同浓度D-ONC作用于MCF-7及Hep G2细胞48 h后,观测其细胞形态并测定吸光度。结果显示,不同浓度组之间的细胞抑制率及肿瘤细胞形态均存在差异,D-ONC对MCF-7及Hep G2细胞的IC分别为2.8、3.3μmol/L。综上所述,本研究成功构建了重组质粒p GAPZαMUT-D-ONC,并在毕赤酵母中正确表达出Onconase偶聚体;优化毕赤酵母表达条件后,提高了D-ONC表达量;中试发酵产物分离纯化处理,得到的D-ONC用于体外活性研究,初步证实D-ONC具有一定的抗肿瘤活性作用,为D-ONC进一步研究奠定理论基础。
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