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核糖核酸酶Onconase制备过程优化研究

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核糖核酸酶Onconase制备过程优化研究

作者：郭红华东理工大学

学位级别：硕士

豹蛙酶（Onconase,简称ONC）是一种从北极豹蛙卵母细胞和早期胚胎中提取的核糖核酸酶,属于RNase A超家族,研究证实其对许多肿瘤细胞和实体肿瘤都具有杀伤作用。以一株表达豹蛙酶的基因工程菌为研究对象,分别在摇瓶和3.7L小型发酵罐... 详细信息

豹蛙酶（Onconase,简称ONC）是一种从北极豹蛙卵母细胞和早期胚胎中提取的核糖核酸酶,属于RNase A超家族,研究证实其对许多肿瘤细胞和实体肿瘤都具有杀伤作用。以一株表达豹蛙酶的基因工程菌为研究对象,分别在摇瓶和3.7L小型发酵罐中对工程菌发酵工艺进行了优化,确定了接种量2%、IPTG浓度0.5mM、诱导时间3.5小时,菌体内豹蛙酶表达量占胞内蛋白总量的30%以上。进一步对豹蛙酶的纯化工艺进行探索,建立了菌体破碎、包涵体洗涤、蛋白复性、蛋白纯化工艺。文章中采用的复性方法主要是稀释复性。为得到最优的复性条件,本实验对不同复性温度研究,结果表明当复性温度在4℃时,复性效果最优;对复性缓冲液中盐类（主要是精氨酸和尿素的选择）研究,结果表明当复性缓冲液中加入0.5M的精氨酸时,复性效果最优;对复性缓冲液中尿素浓度研究,结果表明当复性缓冲液中加入尿素浓度为2M时,复性效果最优;对GSSG加入复性缓冲液的时间研究,结果表明在2M尿素体系下,包涵体加入缓冲液之前加入GSSG复性效果最优。对四种蛋白质复性体系研究（包括尿素浓度为2M,尿素浓度1.5M,包含精氨酸,酸沉法所用）,结果表明各个复性体系均可使得豹蛙酶电泳纯度达到90%以上,精氨酸体系所得到的蛋白的回收率达到30%以上。

关键词：癌症 Onconase 复性分离纯化

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Onconase研究与开发的最新进展

中国细胞生物学学报 2010年第6期32卷 927-934页

作者：田雪王庆诚沈如凌徐殿胜费俭华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237 上海南方模式生物研究中心上海201210

Onconase是一种在北方豹蛙(Rana pipiens)卵母细胞和早期胚胎内存在的核糖核酸酶,是RNase A超家族中的一员,研究证实它在体内外对多种肿瘤均具显著杀伤作用。Onconase目前已经作为抗肿瘤药物上市,用于治疗恶性间皮瘤。Onconase结构独特... 详细信息

Onconase是一种在北方豹蛙(Rana pipiens)卵母细胞和早期胚胎内存在的核糖核酸酶,是RNase A超家族中的一员,研究证实它在体内外对多种肿瘤均具显著杀伤作用。Onconase目前已经作为抗肿瘤药物上市,用于治疗恶性间皮瘤。Onconase结构独特,高度稳定。在临床上,Onconase具有副反应较轻,免疫原性低和不易产生耐药性等优点。因此Onconase的研究在学术上和医学应用上均具重要意义。本文综述了Onconase的结构特点、催化专一性、细胞毒性、体内外抗肿瘤活性及其临床应用的最新进展,并讨论了与其相关的一些重要问题。

关键词： Onconase RNase 抗肿瘤免疫毒素

抗肿瘤蛋白Onconase的原核细胞表达及细胞毒性检测

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实验生物学报 2004年第3期37卷 227-231页

作者：许国峰王庆诚龚兴国费俭浙江大学生命科学院杭州310027 南方模式动物中心上海201203

本文主要利用pET22b(+)表达载体在大肠杆菌中表达一种在两栖类蛙(Rana pipiens)卵细胞内存在的核糖核酸酶—Onconase。通过包涵体复性、蛋白纯化等程序最终获得与天然蛋白活性相似的重组蛋白,并检测Onconase 对源于皮肤T 细胞淋巴瘤的Hu... 详细信息

本文主要利用pET22b(+)表达载体在大肠杆菌中表达一种在两栖类蛙(Rana pipiens)卵细胞内存在的核糖核酸酶—Onconase。通过包涵体复性、蛋白纯化等程序最终获得与天然蛋白活性相似的重组蛋白,并检测Onconase 对源于皮肤T 细胞淋巴瘤的Hut-78肿瘤细胞的毒性(IC_(50)=0.5μmol/L),证明Onconase 用于抗淋巴瘤的可行性。

关键词：抗肿瘤蛋白 Onconase 表达细胞毒性核酸酶淋巴瘤

Onconase对B16黑色素瘤细胞的体内外生长抑制作用

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细胞生物学杂志 2007年第6期29卷 901-904页

作者：沈如凌孙瑞林王庆诚欧伶费俭华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237 中国科学院上海生命科学研究院上海200031 上海南方模式生物科技发展有限公司上海201203

Onconase(Onc)是一种从林蛙(Rana pipiens)卵细胞内提取的核酸酶,实验证实其在体外和体内对多种肿瘤细胞都具有显著的杀伤效果。在大肠杆菌中表达纯化的重组Onc和天然提取蛋白质具有相似的活性,通过测定该蛋白质对黑色素瘤B16细胞的IC5... 详细信息

Onconase(Onc)是一种从林蛙(Rana pipiens)卵细胞内提取的核酸酶,实验证实其在体外和体内对多种肿瘤细胞都具有显著的杀伤效果。在大肠杆菌中表达纯化的重组Onc和天然提取蛋白质具有相似的活性,通过测定该蛋白质对黑色素瘤B16细胞的IC50和建立荷瘤小鼠模型探讨了Onc体内外的抗肿瘤效果。实验结果表明:B16细胞在体外对Onc敏感性较K562细胞低,其IC50为6.37μmol/L;但体内每次每只小鼠给予5mg/kg Onc也可显著地抑制B16细胞的生长,延长小鼠的生存时间。实验提供了一种简化高效获得具有天然活性Onc的方法,同时通过Onc对低敏感性肿瘤黑色素瘤细胞的杀伤研究,丰富了对Onc抗肿瘤作用的认识,为治疗黑色素瘤提供了线索。

关键词： Onconase 黑色素瘤动物模型抗肿瘤

糖基化与非糖基化Onconase在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达、纯化与活性鉴定

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糖基化与非糖基化Onconase在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达、纯化与...

作者：何庆中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

Onconase,也称作P-30蛋白,是一种提取自北极豹蛙胚胎的强碱性核糖核酸酶。它由104个氨基酸组成,氨基酸序列与三维结构分析显示它属于牛胰腺核糖核酸酶A超家族。但Onconase与RNase A也存在不同之处:(1)Onconase含有牛胰腺核糖核酸酶A超... 详细信息

Onconase,也称作P-30蛋白,是一种提取自北极豹蛙胚胎的强碱性核糖核酸酶。它由104个氨基酸组成,氨基酸序列与三维结构分析显示它属于牛胰腺核糖核酸酶A超家族。但Onconase与RNase A也存在不同之处:(1)Onconase含有牛胰腺核糖核酸酶A超家族特有的Cys87-cys104二硫键,该二硫键使其C端残基折向中央的β折叠片而形成了Onconase特有的结构(2)Onconase的N端含有焦谷氨酸残基。该非编码的残基是由当Onconase N端的谷氨酰胺暴露时自动环化形成的。该环化结构为Onconase生物活性所必须的结构。 Onconase对肿瘤细胞具有细胞毒性和细胞抑制性,能够较好地抑制裸鼠体内移植肿瘤细胞的生长。尽管其细胞毒性的机理仍未完全搞清楚,但Onconae的阳离子性和核糖核酸酶抑制剂的不亲合性是其具有细胞毒性的重要原因。阳离子性能够使Onconase与肿瘤细胞的表面阴离子结合,核糖核酸酶抑制剂的不亲合性能够使通过胞吞作用进入细胞质内的Onconase降解靶RNA(主要是tRNA)。抑制蛋白质生物合成最终导致肿瘤细胞凋亡。最近有文献报道,非编码RNA也与Onconase介导的细胞凋亡有关。目前临床上使用的Onconase均为从北极豹蛙的卵细胞中提取,纯化过程费时又耗力,包括:排卵、提取卵母细胞、体外授精、匀质化、阴离子交换层析、阳离子交换层析和分子筛等步骤。重组DNA技术为许多治疗性蛋白的生产提供了一种有效的替代方法。文献报道利用大肠杆菌表达系统表达的Onconase不能够正确折叠,表达产物最终以包涵体的形式分泌。另外,利用大肠杆菌表达的Onconase在其N端含有多余的Met,该残基阻止了Onconase N端环形结构的形成。为了获得有活性的Onconase,必须对包涵体进行变性、复性和去除N端Met的复杂操作,利用大肠杆菌表达Onconase的产量约为5-50 mg L-1培养基。本研究包括以下3方面的内容:(1)优化Onconase的表达:韩国的Kim等利用PHO1作为分泌信号引导Onconase在巴斯德毕赤酵母中表达,但α交配因子是目前巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白时最常用的分泌信号,研究发现选择合适的分泌信号对于外源蛋白的表达量会产生很大的影响。因此,优化分泌信号是提高Onconase在巴斯德毕赤酵母中表达量的有效方法。(2)评价巴斯德毕赤酵母是否是大规模生产Onconase的最佳宿主:Onconase在巴斯德毕赤酵母中的表达量约为10 mg L-1左右,该表达量与利用其他表达系统时相当。然而,已有大量文献证实采用高密度发酵培养能够将外源蛋白的表达量提高10倍。Onconase具有稳定的化学结构,而对多种蛋白酶的钝化作用使其能够在发酵上清中达到很高的浓度。(3)糖基化和非糖基化形式Onconase活性的比较:过去曾认为糖基化能够增加Onconase结构的稳定性,因此提高了Onconase对K-562的细胞毒性。然而,最新的研究证明Onconase的细胞毒性和细胞抑制性主要取决于它的核糖核酸酶活性,因此,糖基化能否提高Onconase细胞毒性需要在正常细胞和其他肿瘤细胞中进一步证实。该研究证明了在巴斯德毕赤酵母中最常用的α交配因子分泌信号并非是Onconase的最适分泌信号:当利用不含EAEA空间结构的α交配因子作为分泌信号时,α交配因子的pro肽部分不能被Kex2蛋白酶从Onconase中正常切除,从而导致表达产物为未经加工的高度糖基化的Onconase前体;当利用含EAEA空间结构的α交配因子作为分泌信号时,α交配因子的pro肽部分能够完全被Kex2蛋白酶从Onconase中正常切除,但是,EAEA空间结构却不能被Ste13蛋白酶从Onconase中切除,导致了Onconase的N端带有多余的空间结构,阻止了其N端环形结构的形成,最终使表达产物没有生物学活性。对于一些N端具有特殊结构的外源蛋白来说,pro肽或EAEA空间结构的不完全切割往往是造成其表达量低或表达产物没有生物学活性的主要原因,然而,目前对于这类蛋白遇到的问题,还没有统一的解决办法。该研究利用α交配因子的pre肽部分作为分泌信号时,目的蛋白产量高,纯化过程简单,且具有良好的生物活性,说明α交配因子pre肽部分的信号肽酶对于Onconase的N端特殊结构不敏感。为上述问题提供了一种解决方法。该策略同样可以用于面临相同问题的其他外源蛋白。通过分泌信号的优化,我们证明了巴斯德毕赤酵母是大规模制备Onconase的最佳宿主。然而,由于糖基化形式对药物免疫原性和药代动力学具有一定的不利影响,因而对于糖基化形式Onconase的应用目前尚还存在很大的争议和不确定性。因此,对于糖基化形式Onconase的研究,还有大量的试验验证需要展开。

关键词： Onconase 巴斯德毕赤酵母分泌信号糖基化细胞毒性

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抗肿瘤核糖核酸酶Onconase研究进展

中国生化药物杂志 2005年第5期26卷 309-311页

作者：秦孙星李晓波上海交通大学药学院上海200030

Onconase是第一个进入Ⅲ期临床研究的核糖核酸酶药物,用于治疗恶性间皮瘤。属于RNase A超家族,RNase活性低,细胞毒性强,体内、体外对多种肿瘤具显著杀伤作用;同时具有抗病毒活性,尤其是抗人类免疫缺陷病毒功能是今后研究和开发的重点。... 详细信息

Onconase是第一个进入Ⅲ期临床研究的核糖核酸酶药物,用于治疗恶性间皮瘤。属于RNase A超家族,RNase活性低,细胞毒性强,体内、体外对多种肿瘤具显著杀伤作用;同时具有抗病毒活性,尤其是抗人类免疫缺陷病毒功能是今后研究和开发的重点。此文综述了Onconase的研究历史与现状,包括Onconase的结构和功能之间的关系,抗肿瘤、抗病毒作用的机制,药物开发进展、毒副反应等。

关键词： Onconase 核糖核酸酶抗肿瘤抗病毒 Ⅰ型人类免疫缺陷病毒